甘蓝型油菜花和种子特异表达基因的筛选及启动子鉴定

摘要

甘蓝型油菜（Brassica napus）是我国最重要的油料作物，也是我国食用植物油的几大来源之一。2009年起菜籽油就占我国油料作物产油的57％，但是国内食用植物油自给率却不到40%，而且南方冬闲田油菜含油量及产量较低、抗性较弱并且不适合机械化操作，所以分离出应用价值较高的启动子来提高油菜光合效率和抗性等性状，扩大其种植面积与产量，对解决我国植物油问题具有重大意义。组织特异启动子是调控基因在特定的器官或组织部位表达的启动子，相较于组成型启动子驱动外源基因表达造成浪费及在特定部位表达量不足等缺点，具有极大优势，还能有效避免转基因作物在种植中发生基因逃逸现象，对解决转基因环境安全问题具有重大意义。所以，从甘蓝型油菜中分离并鉴定出油菜自身组织特异性启动子，研究其转录调控的分子机制，能为油菜和其近缘物种的基因功能研究及基因工程改良奠定基础。本研究首先根据拟南芥基因芯片和白菜与甘蓝表达谱数据，筛选在根、茎、叶、花和花蕾、角果皮、种子组织中特异表达候选基因，并利用实时荧光定量PCR方法对候选基因进行组织特异性检测和表达模式分析；其次，利用5'RACE技术获得其准确的转录起始位点，通过同源克隆方法获得SP3-1、SP6-1、ST-8-1、SC-2和FL-2启动子序列，并利用PlantCARE数据库对其顺式调控元件进行了预测和分析。最后，利用双酶切技术构建相应的植物表达载体并通过农杆菌介导法遗传转化拟南芥，然后对转基因植株进行PCR验证并分析启动子的表达强度和特异性。同时为了进一步研究甘蓝型油菜花和种子的特异表达基因，利用Illumina测序技术（基于RNA-seq），对甘蓝型油菜品种中双11的不同组织器官和不同发育时期的种子进行了转录组测序，分别将花和种子的转录组与其他组织器官转录组结果进行比较分析，以及特异表达基因分析，筛选具有花和种子特异表达的候选基因。最后，分别从筛选出的种子和花特异表达基因中各选取10个基因，设计引物，进行定量PCR实验，验证并分析候选基因的特异性，为后续开发甘蓝型油菜组织特异表达启动子奠定了坚实的基础。　　本研究主要内容包括：⑴采用生物信息学分析方法从拟南芥基因芯片及白菜与甘蓝表达谱数据中筛选鉴定了出10个组织特异表达的候选基因，从这10个候选基因中获得了5个组织特异表达基因，qPCR分析结果表明SP3-1和SP6-1在荚果皮中特异表达、ST-8-1在茎中特异表达、SC-2在种皮中特异表达，FL-2在花器官中特异表达。通过对qPCR检测片段、5'RACE末端及基因5'末端序列测序结果分析证实扩增片段是来自qPCR检测为组织特异表达的候选基因，启动子的长度为1173-2400 bp（包含5'-UTR序列），转录起始位点分别位于翻译起始位点上游53-269 bp，并包含核心启动元件TATA-box及多个增强子元件CAAT-box，另外光响应、胁迫响应和激素响应元件也广泛存在于启动子中。⑵克隆获得的5个组织特异启动子片段，分别是SP3-1（2151 bp）、SP6-1（1173 bp）、ST-8-1（2100 bp）、SC-2（2400 bp）和FL-2（1939 bp），利用SalI和NcoI双酶切将SP3-1、SP6-1、ST-8-1及FL-2分别亚克隆到具有相同酶切位点粘性末端的载体骨架pCAMBIA1305.1中，最终成功构建了promoter-GUS载体p1305.1-FL-2P，p1305.1-ST-8-1P，p1305.1-SP3-1P和p1305.1-SP6-1P；同样利用BamHI和NcoI双酶切将SC-2替换pCAMBIA1305.1上的CaMV35S启动子，得到植物表达载体p1305.1-SC-2P，然后将构建的植物表达载体成功转化到农杆菌菌株GV3101中，从而获得其工程菌株。⑶将上述构建成功的植物表达载体和p1305.1-FL-1P，通过农杆菌介导法浸染拟南芥（col生态型）花序，成功获得p1305.1-FL-1P转基因阳性植株28株，p1305.1-SC-2P转基因植株35株。将其培养至T3代，对转基因植株进行了GUS蛋白活性及GUS基因表达模式分析，结果表明FL-1主要在花中表达，为花特异性启动子；SC-2在种子中不表达，不具有种子特异性。⑷使用高通量RNA-seq技术，获得了所有甘蓝型油菜基因在种子萌发48 h的根、下胚轴、子叶、花期的根、茎、叶、花和花蕾及花后5d、9d、30d、46d的种子和角果皮的表达（转录）水平。不同组织器官及不同时期的种子和角果皮样品经过高通量测序后得到高质量测序数据，通过生物信息学分析，得到了全基因组范围的基因转录水平值FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）。筛选花和种子中最高表达量高于其他组织10倍以上的特异表达基因，得到花和花蕾特异基因1380个，种子特异基因2842个。利用Cytoscape中的BinGO对得到的特异表达基因进行GO富集分析，以校正后的P-Value从细胞组件本体、分子功能本体和生物过程对筛选得到的特异候选基因进行GO分类和富集分析，分别各取10个花和种子候选基因，用荧光定量PCR检测其表达量，结果表明筛选的基因均为种子或花特异性表达，证实了RNA-seq结果的准确性。

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1文献综述

1.1植物启动子概述

1.2启动子的结构与分类

1.3植物组织特异性启动子的研究进展

1.4 转录组学技术

1.5 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验仪器设备与试剂

2.3 实验方法与步骤

3结果与分析

3.1组织特异表达候选基因再次筛选

3.2 特异表达基因组织特异性检测

3.3 特异表达基因5'RACE克隆

3.4 甘蓝型油菜组织特异启动子片段的克隆

3.5甘蓝型油菜组织特异启动子promoter-GUS表达载体构建

3.6 p1305.1-FL-1P和p1305.l-SC-2P载体遗传转化拟南芥及转基因植株鉴定

3.7甘蓝型油菜花和种子特异表达候选基因RNA-Seq分析

4 讨论

4.1 组织特异表达候选基因的获取

4.2 启动子顺式元件预测分析

4.3启动子的promoter-GUS载体的构建

4.4 通过根癌农杆菌介导法转化拟南芥获得转基因植株

4.5 FL-1启动子和SC-2启动子表达的时空性

5 主要结论

参考文献

主要缩略词

致谢