基于超抗原SEB的小鼠肺癌免疫基因治疗

摘要

研究背景与目的:肺癌已成为人类头号癌症杀手。我国肺癌的患病率和死亡率仍在不断攀升。在过去几十年，随着手术技术的进步，放化疗治疗，针对表皮生长因子(epithelial growth factor receptor，EGFR)突变的络氨酸激酶抑制剂的使用，肺癌的治疗效果有一定改善，但其总的5年生存率仍小于15％。因此，探索肺癌治疗新方法仍具有迫切的现实意义。肺癌免疫基因治疗是近年来研究的热点之一。肿瘤免疫基因治疗的重要策略之一，是通过核酸分子克隆技术，将特定外源性抗原基因转入肿瘤细胞，使其表达外源性抗原，激活机体免疫系统，杀伤肿瘤细胞。超抗原是由细菌、病毒、寄生虫等分泌一类小分子蛋白质，微量抗原就能强烈激活免疫系统，促进免疫效应细胞的增殖，同时释放免疫细胞因子。葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是发现最早、研究最广泛的超抗原之一，其有多达几十种亚型，诸如SEA、SEB、SEC等，SEB为最常见的亚型之一。SEs作为一类细菌性外毒素，是葡萄球菌感染导致的各种炎性症状的主要原因，这些症状包括发热、腹泻以至感染性休克。不过，近年来也有研究显示，因其强抗原性，SEs可能在肿瘤的免疫治疗中发挥作用。然而，也有研究，SEs的强抗原性可以引入肿瘤细胞中并使其表达。本研究将构建SEB基因表达载体，并研究其对Lewis肺癌荷瘤小鼠的治疗作用。从而探讨以SEB为目的基因的肺癌免疫基因治疗的可行性和具体方法。　　方法:1.以GenBank中SEB基因cDNA序列为模板，密码子优化后，通过化学合成的方法获得目的基因SEB序列，同时设计用于PCR扩增SEB基因的引物，正向引物序列为:5'-AAGTATCTAGAGATGCCACCATG-TACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3';反向引物::5'-GCCGAGGATCC-TCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3。引物的5'端分别设计有XbaⅠ(TCTAGA)、BamHⅠ(GGATCC)酶切位点。2.通过核酸分子克隆技术将SEB基因克隆到质粒PCDH-CMV-GFP中，构建成SEB表达质粒PCDH-SEB-GFP;并用测序方法和酶切方法进行鉴定。3.用脂质体将构建的PCDH-SEB-GFP重组质粒转染体外培养的小鼠Lewis肺癌细胞，并用Western Blot检测转染细胞中SEB蛋白的表达情况。4.将小鼠Lewis肺癌细胞接种到C57小鼠右侧腋下（3×106个细胞/只），当肿瘤体积约为50mm3时，将小鼠分为实验组、阴性对照组和空白对照组，每组6只小鼠。实验组小鼠瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒，阴性对照组瘤内注射空载质粒PCDH-CMV-GFP，空白对照组注射等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)。质粒注射每3天一次，共3次，每次质粒用量为20ug，脂质体20ul，用无血清培养基调整至100ul。每2天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算瘤体体积，绘制肿瘤生长曲线，最后一次质粒注射后2天，剥出眼球采血，并处死小鼠，完整剥离肿瘤块，测量肿瘤长径和短径，据此计算瘤体体积，比较各组小鼠瘤体体积;用电子天平称量肿瘤质量，比较各组小鼠平均瘤重的差异。5.取各组小鼠肿瘤组织作常规HE染色，观察肿瘤组织有无坏死，以及有无炎细胞浸润;用免疫组化方法检测肿瘤组织中SEB表达情况;酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法检测各组小鼠血清中细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的浓度。　　结果:1、本研究合成的SEB基因长度为801bp，通过琼脂糖凝胶电泳、基因测序鉴定，基因大小及序列与预期结果完全一致。2、成功构建SEB基因表达质粒，测序和酶切鉴定结果与预期结果一致。3、用脂质体方法将PCDH-SEB-GFP和PCDH-CMV-GFP质粒分别转染小鼠Lewis肺癌细胞，24小时后，部分细胞内可见绿色荧光，转染效率约40％; Western blot实验结果显示，转染PCDH-SEB-GFP质粒的Lewis肺癌细胞中有SEB蛋白表达，而转染空载体PCDH-CMV-GFP质粒的Lewis肺癌细胞及空白组（未转染）无SEB蛋白表达。4、成功构建Lewis肺癌细胞C57小鼠肿瘤模型，小鼠成瘤率100％，成瘤期间小鼠无死亡。实验组（瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒）小鼠平均瘤体体积、瘤体质量小于对照组，空白组小鼠瘤体总体积、质量明显大于其余2组。5、HE染色显示实验组所有小鼠肿瘤剖面见出血、坏死区，阴性对照组少数肿瘤可见灶性小坏死区，空白组肿瘤无明显坏死区域;实验组和阴性对照组有炎性细胞浸润，其中实验组更明显，空白对照组无明显炎细胞浸润;免疫组化实验显示，实验组部分肿瘤细胞表达SEB，其余两组肿瘤内无表达SEB细胞;ELISA结果提示各组细胞因子水平无明显差异。　　结论:1、通过质粒脂质体转染方法，超抗原SEB原核细菌基因能在Lewis肺癌细胞中表达。2、超抗原SEB基因能抑制小鼠肿瘤生长。

目录

摘要

前言

第一部分 SEB基因表达载体构建和鉴定

一 主要实验材料及仪器

二 实验方法

1．SEB基因的合成及测序

2．SEB基因表达载体的构建

3．SEB基因表达载体的鉴定

(三)实验结果

第二部分 超抗原SEB对小鼠Lewis肺癌体内抑制实验

一 主要实验材料及仪器

二 实验方法

1．Lewis肺癌细胞培养

2．实验动物饲养条件

3．建立荷瘤小鼠

4．实验动物分组、治疗实验

5．实验动物检测指标

6．小鼠血清细胞因子浓度检测

(三)实验结果

讨论

参考文献

致谢

非小细胞肺癌免疫治疗的进展 综述

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