基于microRNAs肺结核诊断模型的构建及在肺结核诊断中的价值研究

摘要

目的：　　肺结核（pulmonary tuberculosis，PTB）的快速准确诊断对结核病(tuberculosis，TB)防治工作至为关键，然而该问题至今仍然困扰着临床医务工作者。当前PTB的诊断策略是结合患者临床表现、影像学资料以及实验室检查结果等综合作出判断，但是现阶段PTB的实验室诊断方法尚存在着局限性，传统微生物学方法如抗酸染色法、分离培养法是当前实验室检验的主要手段，但存在着阳性率较低，或检测周期长等缺陷;现代分子生物学方法如Xpert MTB/RIF法虽提高了诊断的阳性率，实现了对结核杆菌的快速检测，但对仪器设备要求高、费用昂贵等。另外，PTB的临床表现及影像学结果缺乏特异性，常常难以对肺结核与其他肺部疾病如肺炎及肺癌等作出鉴别诊断，因此研究者们一直在寻求更为理想的PTB诊断方法。microRNA（miRNA）与疾病发生发展密切相关，已作为肿瘤等疾病的诊断指标，为PTB实验室诊断提供了一种新的思路。多项研究证据显示TB患者体内存在着miRNAs表达失调，表达变化的miRNAs可用于PTB的辅助诊断。然而，现阶段对miRNAs诊断PTB的研究更多的还只是停留在筛选诊断指标的层面上，有必要在此基础上继续进行深入研究与探索。本研究即在现有研究资料的基础上，选取多种已报道过的可用作PTB诊断标记物的miRNAs，以qRT-PCR技术检测并进行筛选，通过logistic回归分析获得回归方程，并进一步采用独立样本验证该方程的诊断效能，旨在建立一个基于miRNAs的PTB诊断模型，以期能够对现有的PTB诊断方法进行有效补充。　　方法：　　实验分为4组:健康组、肺炎组、肺癌组和PTB组，实验设计为三大部分:miRNAs筛选、诊断模型构建和诊断模型验证。(1) miRNAs筛选:共纳入研究对象178例，其中PTB组70例，健康组、肺炎组和肺癌组各36例。首先选取8种文献已报道过的在PTB患者中存在异常表达的miRNAs，以qRT-PCR技术检测它们在178例研究对象中的表达水平;然后对检测结果进行数据处理和统计学分析，选取符合筛选标准的miRNAs进入后续研究。(2)诊断模型构建:应用miRNAs筛选阶段的检测数据，对符合筛选标准的miRNAs进行多因素logistic回归分析，采用向前逐步法筛选变量，建立回归方程，并以ROC曲线分析评价该方程的诊断效能。(3)诊断模型验证:为更准确评价所构建模型的诊断效能，采用独立样本进行ROC曲线分析验证，此阶段纳入共研究对象200例，其中PTB组80例，健康组、肺炎组和肺癌组各40例。　　结果：　　1.miRNAs筛选:筛选标准为PTB组与肺炎组、肺癌组及健康组分别进行两两比较，三对比较中至少有一对满足miRNA表达水平有差异且相对变化倍数≥2或≤0.5。8种miRNAs(miR-21、miR-29a、miR-101、miR-146a、miR-223、miR-361-5p、miR-378和miR-424)中，miR-29a的表达水平差异虽有统计学意义，但因其在有表达差异的一对比较（PTB组VS肺炎组）中表达水平的变化倍数为0.7，不符合筛选标准而被排除，剩余7种miRNAs均符合实验要求。　　2.诊断模型构建:采用向前逐步法:似然比法筛选变量，成功构建了基于3种miRNAs(miR-101、miR-223和miR-424)的诊断模型，其余4种miRNAs被剔除。应用miRNAs筛选阶段数据，ROC曲线分析证实了该模型对PTB具有良好的诊断效能，AUC=0.92，95％CI:0.87～0.95，诊断灵敏性为90.0％，特异性为84.3％。　　3.诊断模型验证:采用独立样本，ROC曲线分析证实了该模型对PTB具有良好的诊断效能，AUC=0.89，95％ CI:0.84～0.93，诊断灵敏性为86.3％，特异性为80.8％。考虑到临床上PTB经常要与肺炎和肺癌进行鉴别，我们也分析了该模型对PTB与上述两种疾病的鉴别能力。结果显示:与肺炎鉴别，AUC=0.91，95％CI:0.86～0.96，诊断灵敏性为90.0％，特异性为80.0％;与肺癌鉴别，AUC=0.92，95％ CI:0.86～0.96，诊断灵敏性为88.8％，特异性为85.0％。　　结论：　　1.在文献调研基础上选择了8种miRNAs进行研究，经qRT-PCR技术检测，7种miRNAs(miR-21、miR-101、miR-146a、miR-223、miR-361-5p、miR-378和miR-424)在肺结核、肺炎和肺部肿瘤组中差异明显，确定该7种miRNAs进入后续研究。　　2.对7种候选miRNAs（miR-21、miR-101、miR-146a、miR-223、miR-361-5p、miR-378和miR-424）进行多因素logistic回归分析，构建成功了一个基于3种miRNAs即miR-101、miR-223和miR-424的诊断模型:logit（患PTB概率P）=6.214-1.480*(miR-101)-0.002*(miR-223)-0.051*(miR-424)。该诊断模型对肺结核的诊断效能为:AUC=0.92，95％CI:0.87～0.95，诊断灵敏性为90.0％，特异性为84.3％。　　3.采用独立样本（PTB组80例，健康组、肺炎组和肺癌组各40例）经ROC曲线验证，证实该模型对PTB具有潜在的诊断价值:AUC=0.89，95％ CI:0.84～0.93，诊断灵敏性为86.3％，特异性为80.8％。

目录

声明

缩略语表

摘要

1．前言

2．材料和方法

2．1 材料

2．2 方法

3．结果

3．1 临床资料

3．2 miRNAs筛选阶段结果

3．3 模型构建阶段结果

3．4 独立样本验证阶段结果

4．讨论

4．1 所构建模型的诊断价值

4．2 构建模型的miRNAs与结核感染相关

4．3 总结

全文结论

参考文献

文献综述 microRNA：潜在的诊断结核病的新型生物标记物

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢