尿酸调控脂肪组织RAS及其与肥胖性高血压的相关性

摘要

背景:　　高血压病是最常见的肥胖相关性疾病。肥胖性高血压病因十分复杂,迄今尚未完全阐明。高尿酸血症(Hyperuricemia, HUA)是肥胖患者常见的代谢紊乱状态。近年来,有大量研究发现,血尿酸与多种心血管疾病和代谢性疾病密切相关,如高血压病、肥胖、2型糖尿病、代谢综合征等。这些疾病中,血尿酸与高血压发病机制之间的联系引起研究者极大的兴趣。尽管具体的机制尚不清楚,但来自流行病学、临床试验和动物实验的数据表明,高尿酸血症参与了肥胖性高血压的发病。　　文献报道,脂肪组织几乎表达肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)的全部组分[1]。动物实验的研究数据表明,白色脂肪组织所表达的血管紧张素原(Angiotensinogen, AGT)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是循环池RAS的重要来源,在机体血压调控中发挥重要作用[2]。脂肪组织AGT缺乏的小鼠血浆AGT水平更低,收缩压随之降低[3]。研究发现,原发性高血压患者血浆肾素浓度与血尿酸水平明显正相关[4]。然而,血浆AGT浓度与血尿酸之间在肥胖的原发性高血压患者中是否存在关联,目前尚不清楚。　　迄今为止,研究者发现有多种因素与脂肪组织RAS的调控相关[5],包括机体的营养状态、胰岛素、糖皮质激素、游离脂肪酸、雄激素、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNFα)以及环磷腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)等。体外实验发现,尿酸可以对几种组织RAS发挥调控作用,包括永生化人系膜细胞(Immortalized human mesangial cells, ihMCs)组织RAS[6]、人血管内皮细胞(Human vascular endothelial cells, HVECS)组织RAS[7]、血管平滑肌细胞(Vascular smooth cells, VSMCs)组织RAS[8]。肥胖患者脂肪组织RAS处于过度活跃状态[9]。针对这种有趣的现象,最常见的解释是:与体型正常的个体比较,肥胖患者体内脂肪含量明显增多。研究发现,尿酸与脂肪组织 RAS均在肥胖性高血压发病中发挥重要作用,由此推断,尿酸很可能对脂肪组织RAS表达也发挥调控作用。　　众所周知,肥胖性高血压是一种氧化应激相关性心血管疾病[10]。多个研究证实,在一定条件下,尿酸可以诱导氧化应激发生。据报道[11],高浓度尿酸作用于3T3-L1脂肪细胞,可以明显增加细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)水平。虽然发现尿酸是通过上调NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)活性诱导脂肪细胞氧化应激的,然而,研究者并未阐明尿酸增加NOX活性具体的分子机制。　　针对以上问题,本课题尝试通过体外实验和临床研究两个层面进行深入探索。首先,利用3T3-L1脂肪细胞作为实验模型,我们研究尿酸是否可以对脂肪组织RAS发挥调控作用。接下来,我们探讨脂肪组织RAS激活在尿酸诱导的氧化应激发病分子机制中的作用。最后,以324例未治疗的原发性高血压患者为研究对象,我们观察血尿酸与血浆 AGT浓度是否存在关联,以及这种关联是否因肥胖状态而存在差异。以上研究将为阐明尿酸参与肥胖相关性心血管疾病(尤其是高血压病)的发病机制提供新的视角。　　方法:　　1.以不同浓度的尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用未分化的前脂肪细胞48小时,或以高浓度尿酸(5、15 mg/dl)作用于分化第4天的3T3-L1脂肪细胞48小时。实时RT-PCR检测AGT mRNA水平。　　2.不同浓度尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞48小时,或以15 mg/dl尿酸作用于成熟脂肪细胞不同时间(0、24、48、96小时)。部分细胞在15 mg/dl尿酸联合2mM probenecid条件下孵育48小时。实时RT-PCR检测脂肪组织RAS基因表达,酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养液AngⅡ的蛋白表达量。　　3.成熟脂肪细胞在15 mg/dl尿酸联合10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利条件下孵育48小时。分别以实时RT-PCR和ELISA法检测AGT mRNA水平和AngⅡ的蛋白分泌量。以比色法定量检测NOX的酶活性。　　4.成熟脂肪细胞以高浓度尿酸(5、15 mg/dl)干预48小时。另外,部分细胞在15 mg/dl尿酸联合RAS抑制剂(10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利)条件下孵育,部分细胞在15 mg/dl尿酸联合10mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)或200μM apocynin(一种NOX抑制剂)条件下孵育。荧光探针2',7'-二氯双乙酸盐(2′,7′- dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)或二氢罗丹明(Dihydrogen rhodamine123, DHR)或NBT法检测细胞内活性氧含量。定性检测采用荧光显微镜,定量检测采用荧光酶标仪。　　5.临床研究共纳入162例未经治疗的肥胖的男性高血压患者,同期纳入162例与之年龄相匹配的男性非肥胖高血压患者。人体学指标由专门护士测量,包括血压、身高、体重、腰围、臀围等。全自动生化分析仪检测空腹血糖、血尿酸、血肌酐和血脂水平。空腹胰岛素(Fasting insulin levels, FINS)水平以放射免疫法检测。稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)用于衡量机体胰岛素抵抗程度。血浆AGT浓度以ELISA法检测。　　6.肥胖高血压组与非肥胖高血压组组间指标比较采用独立样本t检验或卡方检验。肥胖高血压组与非肥胖高血压组按尿酸三分位数分别再划分为三个亚组,采用单因素ANOVA进行组间比较,采用Bonferrroni’spost hoc检验进行两两比较。尿酸与其他参数的相关性采用偏相关分析(调整年龄、吸烟史、饮酒史)。肥胖高血压人群血尿酸对血浆 AGT水平的独立影响以多元回归模型进行分析与评估。统计分析采用SPSS17.0软件,作图采用GraphPad prism5.0软件。　　结果:　　1.不同浓度的尿酸对未分化的前脂肪细胞AGT mRNA表达无明显作用(P>0.05)。然而,高浓度尿酸(5、15 mg/dl)可以使分化中的3T3-L1脂肪细胞AGT mRNA表达明显增加(均P<0.05)。　　2.分化成熟的脂肪细胞在生理浓度尿酸(1 mg/dl)作用下,AGT mRNA变化不明显(P>0.05),但高浓度尿酸(5、15 mg/dl)作用可以使脂肪组织RAS基因表达和AngⅡ蛋白分泌量明显上调(均P<0.05)。15 mg/dl尿酸作用于脂肪细胞24小时,AGT mRNA变化不明显(P>0.05);作用48小时或96小时,AGT mRNA表达和AngⅡ蛋白产量明显增加(均P<0.05)。而且,尿酸对脂肪RAS的调控作用具有浓度依赖性和时间依赖性特点。另外,阴离子转运子(Organic anion transporter, OAT)抑制剂probenecid可以明显减弱尿酸对脂肪组织RAS的活化作用。　　3.与单纯高尿酸组(15 mg/dl)比较,10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利联合高尿酸组AGT mRNA和AngⅡ蛋白水平均明显减少(均P<0.05)。并且,氯沙坦和卡托普利可以使高浓度尿酸激活的NOX酶活性显著下降(均P<0.05)。　　4.高浓度尿酸(5、15 mg/dl)使脂肪细胞内ROS水平明显增加(均P<0.05)。RAS抑制剂氯沙坦和卡托普利可以明显减少高浓度尿酸作用下的脂肪细胞内 ROS水平(均P<0.05)。而且,抗氧化剂NAC或NOX抑制剂apocynin联合高尿酸培养脂肪细胞,也能降低细胞内ROS水平(均P<0.05)。　　5.肥胖高血压患者腰围、腰臀比和体重指数显著升高。此外,与非肥胖高血压患者比较,肥胖高血压患者饮酒比例增高,甘油三酯、空腹血糖、血尿酸、AGT、FINS、HOMA-IR及收缩压升高(均P﹤0.05)。按尿酸三分位数将患者划分为三个亚组,结果显示,肥胖高血压患者最高尿酸三分位数组(血尿酸435.9~642.2μmol/L)与最低尿酸三分位数组(血尿酸282.7~373.6μmol/L)比较,AGT(P﹤0.001)、FINS(P=0.002)、HOMA-IR(P=0.007)均明显升高。然而,非肥胖高血压患者组按尿酸三分位数划分后,没有发现类似差异(P>0.05)。　　6.调整年龄、吸烟史、饮酒史后,偏相关分析结果显示,肥胖高血压患者血尿酸与AGT(r=0.437, P﹤0.001)、FINS(r=0.245, P=0.002)、HOMA-IR(r=0.237, P=0.003)明显相关。然而,非肥胖高血压患者血尿酸与 AGT、FINS以及 HOMA-IR无明显相关性(P>0.05)。多元逐步回归分析结果显示,交互变量“肥胖×尿酸”独立影响高血压患者血浆AGT水平(β=0.257, P﹤0.001)。　　结论:　　1.尿酸可以上调分化中和分化成熟的脂肪组织RAS表达,但对未分化的前脂肪细胞无此作用。尿酸必须通过尿酸盐转运子进入脂肪细胞内,才能发挥对脂肪组织RAS的调控作用。　　2.脂肪组织RAS过度激活参与了尿酸诱导的氧化应激发病的分子机制:尿酸上调脂肪组织RAS,增加AngⅡ产生,继而激活NOX活性、增加脂肪细胞内ROS水平,最终诱导氧化应激发生。　　3.高血压患者血尿酸水平与血浆AGT浓度明显正相关,这种关联具有“肥胖依赖性”的特点。此外,肥胖高血压患者血尿酸与空腹胰岛素以及胰岛素抵抗水平密切相关。

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尿酸调控脂肪组织RAS及其与肥胖性高血压的相关性

第一章 前 言

第二章 尿酸对脂肪组织RAS的调控作用

2.1 材料与方法

2.1.1 主要仪器、耗材与试剂

2.1.2主要试剂配制方法

2.1.2实验方法

2.2 结果

2.2.1 3T3-L1细胞的分化与鉴定

2.2.2脂肪组织RAS基因表达的检测

2.2.3尿酸对未分化的3T3-L1细胞AGT mRNA表达的作用

2.2.4尿酸对分化中3T3-L1细胞AGT mRNA表达的作用

2.2.5 不同浓度尿酸对成熟3T3-L1细胞脂肪组织RAS表达的作用

2.2.6 尿酸作用不同时间对成熟3T3-L1细胞脂肪组织RAS表达的作用

2.2.7OAT抑制剂对尿酸作用的脂肪细胞RAS表达的影响

2.2.8 RAS抑制剂对尿酸作用的脂肪细胞RAS表达的影响

2.2.9脂肪组织RAS激活在尿酸诱导的氧化应激中的作用

2.3讨论

2.4 结论

第三章 肥胖高血压患者血尿酸与AGT的相关性

3.1 对象与方法

3.2.1 研究对象

3.1.2研究方法

3.2 结果

3.2.1 肥胖和非肥胖高血压患者基线特征比较

3.2.2 肥胖和非肥胖高血压患者AGT、FINS、HOMA-IR比较

3.2.3 高血压患者按血尿酸水平分组后AGT、FINS、HOMA-IR比较

3.2.4 血尿酸与其他指标的相关性分析

3.2.5 肥胖高血压人群以AGT为因变量的多元回归分析

3.2.6 全体高血压人群以AGT为因变量的多元回归分析

3.3 讨论

3.4 结论

全文总结

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表的论文

致谢