武汉汉族人群TLR4、RAGE基因多态性与糖尿病相关性研究及人体白色脂肪组织TLR4表达与肥胖相关性研究

摘要

第一部分、武汉汉族人群TLR4、RAGE基因多态性与糖尿病相关性研究。 目的: 研究武汉汉族人群TLR4基因Asp299Gly、RAGE基因1704G/T，G82S单核苷酸多态性与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及其慢性并发症的关系。 方法：对506名T2DM病人，182名糖耐量正常（normal glucose tolerance，NGT）的个体，运用连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)联合多聚酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）检测TLR4基因Asp299Gly、RAGE基因1704G/T，G82S单核苷酸多态性，并分析它们与T2DM及其慢性并发症的关系。 结果：所有样本未发现TLR4基因Asp299Gly位点变异，均为AA野生基因型；在T2DM和NGT个体中，1704G/T、G82S基因型和等位基因型频率在T2DM和NGT个体中的分布无明显差异。在T2DM中，1704T等位基因者HOMA-β显著低于704G等位基因者（1.68±0.43 VS 1.80±0.37，P=0.03），而且，1704T等位基因者高血压的伴发率低于其他基因型(P=0.001)；82S等位基因者HOMA-β略低于G82等位基因者（1.70±0.4 VS 1.81±0.38，P=0.05），在正常对照组中未发现这种差异。进一步研究发现82S等位基因者视网膜病变的发生率高于G82等位基因者（43.3％VS 23.8％，P<0.001），同时未见这两种基因多态性与其他慢性并发症相关。在T2DM中，糖尿病伴视网膜病变组G82S表现为G/A+AA基因型频率(60.6％)和A等位基因型频率(36.4％)显著高于T2DM不伴糖尿病视网膜病变组(38.8％；20.9％. P<0.05)。由1704G/T和G82S构建的单倍体型分析发现G-A单倍体型发生视网膜病变的危险显著增加[odds ratio(OR) for 2.120，95％confidence interval(CI):1.185-3.792]。多因素logistic 回归分析发现82S等位基因变异和糖尿病病程是T2DM视网膜病变的独立危险因素(OR=2.964，95％CI:1.013-5.46，P=0.029；OR=1.013，95％CI：1.007-1.02，P<0.001)。 结论：在武汉汉族人群中，RAGE基因82S等位基因变异预示胰岛B细胞功能降低，视网膜病变的危险性增加；1704T等位基因变异则预示胰岛B细胞功能降低，但伴高血压比例降低；由1704G/T和G82S构建的单倍体型中，G-A单倍体型是发生糖尿病视网膜病变的基因标记。 第二部分、人体白色脂肪组织TLR4表达与肥胖相关性研究。 目的：最新研究显示脂肪组织在先天免疫反应中起着一定的作用。而且，肥胖者的白色脂肪组织（white adipose tissue，WAT）具有巨噬细胞浸润和脂肪细胞肥大的特征性变化。研究目的是确定人类WAT中TLR4蛋白质表达，并阐明其与肥胖的代谢表型、炎症标志物及白色脂肪组织形态学的关系。 方法：成对摘取30位择期胆结石摘除术的男性患者[年龄，34-60岁；体重指数（body mass index，BMI）：23.8±3.5 kg/m2]的腹部网膜脂肪和皮下脂肪。按标本来源者的体重指数和空腹血糖将标本分为正常体重组、超重非糖尿病亚组和超重糖尿病亚组。Western blot 测定WAT中TLR4的蛋白质表达。免疫组化CD68抗体染色显示活性巨噬细胞。免疫比浊法测定血清高敏C反应蛋白（high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP）。显微镜定量分析巨噬细胞浸润程度和脂肪细胞大小。多元线性回归分析WAT中TLR4蛋白质表达水平与肥胖的表型、hs-CRP及WAT形态学关系。 结果：Western blot明确人类皮下和网膜WAT(omental WAT，oWAT)中有TLR4的蛋白质表达。同一个体皮下WAT(subcutaneous WAT，scWAT)中TLR4的蛋白质表达水平显著低于oWAT(0.20±0.03 VS 0.59±0.19，P<0.001)。超重非糖尿病亚组TLR4的蛋白质表达水平无论oWAT和scWAT均高于正常体重组和超重糖尿病亚组(P<0.01)。超重糖尿病亚组oWAT中TLR4的表达水平亦高于正常体重组(P<0.01)。oWAT中CD68+数是scWAT的4倍(24.4±3.2 VS 6.1±2.9，P<0.001)。超重非糖尿病亚组和超重糖尿病亚组oWAT和scWAT中CD68+数均高于正常体重组(P<0.01)，但超重的两亚组间无明显差异。超重非糖尿病亚组oWAT中平均脂肪细胞直径及横截面积显著大于正常体重组(69.2±19.37μm VS 44.2±10.4μm，P=0.003；4014.1±2443.1μm2 VS 1613.4±755.6μm2，P=0.04)。多元线性回归分析提示：oWAT中蛋白质表达水平与oWAT中巨噬细胞浸润程度(b’=0.635，P<0.001)、BMI(b’=0.201，P=0.02)及hs-CRP(b’=0.211，P=0.044)成正相关。 结论：人类WAT中存在TLR4的表达，肥胖是影响WAT中TLR4表达的主要因素，WAT尤其是oWAT中TLR4与肥胖和糖尿病的慢性低度炎症过程相关，血糖升高使TLR4的炎症作用减弱。