miR--34a沉默逆转靡烂性毒物对角质形成细胞迁移抑制的作用及机制的实验研究

摘要

研究背景和目的:　　微小RNA(miRNA)是机体一类重要的基因表达调控分子，通过与靶mRNA的3'-UTR区域不完全配对结合，抑制其转录和翻译，与机体发育、细胞增殖和分化、DNA损伤修复、凋亡和肿瘤发生等众多生物学事件密切相关。miR-34a是p53诱导的miRNA，在DNA损伤应激中发挥重要作用。芥子气(sulfur mustard，SM)是皮肤损伤剂，引起皮肤炎症、红斑、水疱等病理改变，创面愈合缓慢。目前的研究结果认为芥子气对DNA的损伤作用是其引起病理变化的分子基础。我们推测，miR-34a的表达改变可能在SM对皮肤损伤过程中发挥作用，干预其表达可能会对皮肤的损伤及愈合有影响。因此，本研究中我们用miR-34a的抑制物Ago34a抑制角质形成细胞系HaCaT细胞中miR-34a的表达水平，观察芥子气模拟物CEES(2-chloroethyl ethyl sulfide，2—氯乙基乙硫醚)染毒后，角质形成细胞增殖、迁移、粘附、侵袭等指标的改变，以期明确miR-34a在硫芥损伤的保护作用，并对迁移，粘附，侵袭相关蛋白以及激动蛋白聚合状态(F-actin)等进行检测，以阐明其作用机制。研究结果可为后续在体研究，如使用miR-34a沉默药物治疗芥类毒物皮肤难愈损伤，提供实验资料。　　方法:　　第一部分 CEES染毒HaCaT细胞miR-34a的变化　　1.CEES染毒HaCaT细胞模型建立及评价:采用不同CEES剂量(0.2，0.5，1.0，2.0mM)进行染毒，染毒后6h使用MTS法检测细胞活性，确定后续试验染毒的最佳剂量（该剂量对细胞活性有影响，但细胞可以耐受）。采用该剂量在染毒后24h光镜观察细胞形态变化。　　2.细胞分化标志物检测:根据上述的毒性实验结果，确定0.5mM CEES为最佳染毒剂量，使用该剂量染毒24h后，采用基底细胞未分化标志物角质蛋白5(K5)和分化标志物角质蛋白10(K10)对染毒后细胞的分化情况进行检测，以1.2mM Ca2+诱导分化处理作为阳性对照。　　3.用stem-loop Q-PCR法检测成熟miRNA:使用商品化的miRNA检测用引物，检测方法与试剂与Q-PCR检测mRNA类似。在正式的miRNA检测前，利用溶解曲线评价miRNA检测引物的质量，同时比较U6和5S作为内参在本染毒模型上的稳定性。　　第二部分 miR-34a沉默对CEES染毒前/后细胞迁移，粘附的影响　　1.化学合成miRNA转染实验:通过转染效率实验对转染方法进行评价。用cy3荧光标记和未标记的miRNA抑制剂转染细胞，观察cy3阳性细胞率。miR-34a沉默采用的是商品化的miR-34a沉默(Ago34a)。　　2.Western blotting:实验设计为6组，分组如下，miR-34a沉默转染组(Ago34a)和对照抑制剂转染(Ago ctr)组，0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组，0.5mM CEES染毒对照抑制剂转染组(Ago34a+0.5)，p38抑制剂干预0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组(Ago34a+0.5+P38 inh)，ERK1/2抑制剂干预0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组(Ago34a+0.5+ERK1/2 inh)，染毒后24h检测EGFR，ERK1/2总蛋白，以及p38和ERK1/2磷酸化水平。　　3.细胞划痕实验:实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞运动迁移的能力。　　4.细胞粘附实验:实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞粘附底物的能力。　　5.细胞侵袭实验:实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞穿透基质胶(Matrixgel)的能力。　　6.免疫荧光染色F-actin:实验分组同上。F-actin反映actin的聚合程度，与细胞骨架重塑、迁移、粘附等有关。本实验用于观察各种处理因素下细胞内F-actin的分布和荧光强弱。　　7.流式细胞术分析F-actin:实验分组同上。用于准确反映各种处理因素下细胞F-actin的平均荧光强度。　　8.Western Blotting:实验分组同上。主要检测各种处理因素下与迁移相关的蛋白（miR-34a的靶蛋白或非靶蛋白）的改变。　　9.生物信息学分析:与迁移相关的蛋白HDAC6，在miR-34a沉默后增加。使用TargetScan预测和Vector NTI手工比对，预测HDAC63'-UTR的可能miR-34a结合位点。　　第三部分 miR-34a沉默促CEES染毒细胞迁移的其它因素　　1.流式细胞术检测胞膜蛋白Integrinβ1:实验分组同前。检测了和细胞粘附，迁移相关Integrinβ1可能和细胞黏附，迁移相关。　　2.流式细胞术检测细胞内Ca2+含量:实验分组同前。检测了和Integrinβ1改变相关的Ca2+含量。　　3.HPLC能量代谢检测:实验分组同上。检测了可能和细胞迁移相关的能量代谢的变化。　　4.Western Blotting检测COX-10:实验分组同上。结果反映能量代谢中氧化磷酸化功能酶的含量变化。　　结果:　　1.在本实验室建立了CEES体外染毒模型，发现0.5 mM CEES是最佳染毒剂量。该剂量下染毒HaCaT可以观察到细胞粘附、迁移和侵袭能力均降低。部分功能和结构蛋白如K5、iNOS、MMP-1、Fra-1降低显著，Integrinβ1略有增加。　　2.0.5 mM CEES染毒可以显著降低HaCaT细胞K5(基底细胞marker)。但形态学和K10的WB结果表明，并未有明显的细胞分化迹象。　　3.建立了稳定的stem-loop Q-PCR法检测成熟miRNANA，比较了U6和5S两个内参的稳定性（后者更佳），以此法检测了miR-34a在CEES染毒HaCaT细胞内随时间后剂量变化后的表达，发现miR-34a在0.2，0.5mM CEES染毒后12h-24h表达增加，至24h增加3倍左右，该调控是通过该细胞的突变p53来实现的。　　4.建立了高转染效率的miRNA转染方法。miR-34a沉默可以增加细胞迁移和粘附能力。同样，miR-34a沉默使0.5 mM CEES染毒细胞迁移增加，该迁移能力的变化可以被p38和ERK1/2信号通路抑制剂所降低。miR-34a沉默并未使0.5 mM CEES染毒细胞粘附增加。　　5.miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒后一些迁移相关靶蛋白及信号通路激酶磷酸化增加，如c-myc、c-Met、ARHGAP1、HDAC6，以及p38和ERK1/2的磷酸化。迁移相关的信号蛋白iNOS增加依赖于ERK1/2通路激活。Fra-1作为已报道的miR-34a靶蛋白未见增加。　　6.miR-34a沉默并未显著改变0.5 mM CEES染毒细胞MMP-1，Integrinβ1，Ca2+含量和能量代谢水平。　　7.miR-34a沉默显著增加染毒前/后迁miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒细胞的ERK1/2信号通路激活，经过ERK1/2抑制剂处理后，细胞出现明显的分化状态。伴随着胞内Ca2+浓度和Integrinβ1的明显增加。　　结论及展望:　　miR-34a沉默可以显著增加迁移，并可以部分逆转CEES染毒引起的细胞迁移降低。miR-34a沉默后引起染毒细胞迁移增强的作用机制可能是:(1) p-p38和p-ERK1/2信号通路的激活;(2)c-Met蛋白表达增强，促使该通路的激活;(3)miR-34a靶蛋白ARHGAP1增加，可能引起下游迁移相关蛋白Rho GTPase增加;(4)HDAC6蛋白增加可能使骨架蛋白和组蛋白去乙酰化。　　本课题还有其它方面有待深入:(1)未在动物上开展在体验证实验;(2)使用的是p53突变型细胞株HaCaT，在研究毒性和DNA修复机制方面可能不够全面;(3)miR-34a靶蛋白改变后的功能没有进行干预研究，其作用是根据已有文献推测的。

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