调节性T细胞和树突状细胞Notch信号对哮喘Th1/Th2失衡的影响

摘要

支气管哮喘(哮喘)是一种慢性气道变应性疾病，抗原特异性T细胞的过度活化在哮喘的发病过程中起着关键的枢纽作用。活化的T细胞分泌过多的Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等调控着哮喘的气道炎症过程。过去一直用“Th1/Th2失衡学说”来解释哮喘的发病机制，但哮喘Th1/Th2失衡仅是一个表象，哮喘患者对过敏原的免疫耐受机制存在缺陷才是导致CD4+T细胞活化、增殖，向Th2细胞分化，造成Th1/Th2失衡的重要原因。 调节性T细胞(Treg细胞)是一类诱导和维持外周耐受的重要细胞，但它在哮喘发病中是否存在极化的不足以及它的免疫调节功能是否有缺陷等问题都不完全清楚。树突状细胞(dendriticcell，DC)在哮喘发病中的发挥了关键的调控作用。其生物学性状决定了它调节免疫应答的类型。Treg细胞的诱导分化受到DC的抗原提呈和共刺激信号的影响。但是DC使初始T细胞优先分化为Treg细胞而不是辅助性或记忆性T细胞的确切机制尚不清楚。目前发现，DCNotch1/Serrate1信号转导能诱导Treg细胞的分化。但有关Notch1/Serrate1信号通路在哮喘免疫耐受中的作用及机制尚未见报道。 本研究观察了哮喘和用CD25单抗去除CD4+CD25+T细胞(Treg细胞)的小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞的数量改变、抑制性细胞因子和共刺激分子的表达以及肺部气道炎症表现，检测了来源于哮喘和正常的CD4+CD25+T细胞对CD4+T细胞增殖及细胞因子分泌的影响，并将能够影响Treg细胞分化的Notch1信号分子配体Serrate1基因转染至DC，检测转染后DC的表型和在体内外对哮喘CD4+CD25+T细胞分化的影响，探讨了Treg细胞在哮喘发病中的作用及其极化障碍的分子机制。 研究内容： 1.FCM检测哮喘小鼠BALF中CD4+CD25+T细胞数量及占CD4+T细胞的百分数，RT-PCR法检测哮喘及去除CD4+CD25+T细胞再复制哮喘模型后CD4+T细胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA的表达。 2.分别用相同数量的来源于哮喘、正常小鼠的CD4+CD25+T细胞在体外与哮喘CD4+T细胞共培养后，MTT法检测T细胞的增殖活性，ELISA法检测Th1和Th2类细胞因子的分泌。 3.应用不同剂量rmIL-10雾化处理哮喘小鼠，观察小鼠肺部炎症表现，计数BALF中细胞总数及Eos、淋巴细胞，ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ等Th1和Th2类细胞因子的含量。 4.RT-PCR法扩增小鼠Serrate1全长序列，并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上。 5.应用Lipofectamine2000转染试剂将Serrate1表达载体和筛选载体共转染入DC中，G418筛选。RT-PCR、Westernblot及免疫细胞化学染色法鉴定。 6.FCM检测转染后DC表面CD80、CD86、CD11c、CD8α、MHC-Ⅱ等表面分子的表达，MTT法检测转染后DC对T细胞增殖的影响，ELISA法检测T细胞IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、TGF-β1等细胞因子的分泌。 7.将超表达Serrate1的DC与哮喘CD4+T细胞共同培养后，FCM检测CD4+CD25+T细胞的数量及占CD4+T细胞的百分数，ELISA法检测上清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TGF-β1的含量，免疫细胞化学染色法检测CD4+T细胞表面CTLA-4的表达； 8.将超表达Serrate1的DC经尾静脉注射至小鼠体内后再常规复制哮喘模型，观察其肺部炎症表现，FCM检测BALF中CD4+CD25+T细胞数量及占CD4+T细胞的百分数，RT-PCR法检测小鼠脾脏CD4+T细胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA的表达，ELISA法检测IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ的含量； 结果： 1.哮喘小鼠体内存在明显的CD4+CD25+T细胞数量减少，去除CD4+CD25+T细胞可导致哮喘的抑制性细胞因子分泌明显减少，气道炎症加重。 2.相同数量的来源于哮喘和对照组小鼠的CD4+CD25+T细胞对哮喘Th1、Th2细胞增殖活化及分泌细胞因子的作用无显著差异，而随着CD4+CD25+T细胞的增多，其抑制作用逐渐增强。说明哮喘时主要存在CD4+CD25+T细胞的极化不足，其功能尚正常，且CD4+CD25+T细胞的抑制作用呈数量依赖性。 3.哮喘小鼠支气管、肺组织炎症随rmIL-10处理剂量的增高而逐渐减轻。与对照组小鼠相比，哮喘小鼠BALF中总细胞数、Eos数均显著增多，淋巴细胞亦增多。经最低剂量3ngrmIL-10处理后的哮喘小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞数量较哮喘组明显减少。经3ng、30ng及300ngrmIL-10处理后，BALF中IL-4的含量均较哮喘组明显减低，IL-5的含量在30ng及300ng处理组显著减低，3ng处理组IL-5的含量与哮喘组比较无显著差异。IFN-γ的含量在3ng处理组即有所增高，但在30ng和300ngrmIL-10处理组却明显降低。结果提示，低剂量的rmIL-10能减低过敏原激发后气道Th2细胞因子的分泌，随着rmIL-10剂量的增高，亦能显现出对Th1细胞因子分泌的抑制作用。 4.用RT-PCR法成功扩增出小鼠Serratel基因全长序列，测序正确，并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上。转染DC后经G418筛选后获得阳性细胞克隆，RT-PCR、Westernblot法和免疫细胞化学染色法证实Serratel基因转染细胞中SerratelmRNA和蛋白水平均有强烈表达。 5.转染后DC表面CD80、CD86、CD11c、CD40、CD8α及MHC-II等表面分子的表达与未转染时比较无明显变化，但转染后DC能抑制T细胞增殖，T细胞Th1、Th2类细胞因子的分泌均减少。 6.哮喘小鼠CD4+T细胞Notchl分子表达有所减低，DCSerratel的表达明显减低。超表达Serratel的DC能促进哮喘小鼠CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+T细胞的极化，培养上清中IL-2、IL-4、IL-5含量较对照组明显减少，IL-10、TGF-β1的含量和CD4+T细胞表面CTLA-4表达较对照组明显增多。将超表达Serrate1的DC回输至小鼠体内后可减轻哮喘气道的炎症改变，BALF中IL-2、IL-4、IL-5和IFN-含量明显减低，脾脏CD4+CD25+T细胞数量增多，且脾脏CD4+T细胞IL-10、TGF-β1及CTLA-4mRNA等表达明显增多。 结论： 1.本文发现，去除哮喘小鼠体内的CD4+CD25+T细胞能明显地加重气道炎症，而哮喘小鼠模型因CD4+CD25+T细胞分化障碍而存在数量减少，提示哮喘体内CD4+CD25+T细胞的分化和生成减少可能在哮喘气道炎症的发生发展中具有极为重要作用；哮喘体内CD4+CD25+T细胞的减少可能是对过敏原免疫耐受机制缺陷的重要原因之一。 2.CD4+CD25+T细胞对T细胞的Th2和Th1型免疫应答均有显著的抑制作用，表明CD4+CD25+T细胞是非选择性抑制T细胞活化的重要机制，在诱导免疫耐受中起重要作用。 3.CD4+CD25+T细胞的免疫抑制作用与增加IL-10等抑制性细胞因子的表达有关，是不依赖与影响Th1/Th2平衡而对哮喘气道炎症进行调控的新的途径。 4.Serrate1基因转染后的DC可以显著地抑制T细胞的增殖活化以及Th2和Th1细胞因子的分泌，其作用机制不依赖于对DC表面的共刺激分子的影响，而主要通过Notch1-Serrate1信号转导通路来完成。 5.超表达Serrate1基因的DC在体内外均能促进哮喘CD4+CD25+T细胞的分化，减少活化性Th1、Th2类细胞因子的分泌，增加IL-10等抑制性细胞因子的分泌，从而显著的改善哮喘气道炎症。结果提示DC不仅对T细胞的活化起重要作用，而且在诱导T细胞对过敏原的免疫耐受过程中也起有十分重要的作用。 临床意义： Serrate1基因转染后的DC能有效地逆转哮喘小鼠免疫耐受机制的缺陷，改善哮喘气道炎症，提示超表达Serratel的DC具有重要的潜在临床应用价值，为哮喘的治疗提供了可能的新途径。

目录

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英文缩写一览表

前言

第一部分 CD4+CD25+T细胞在哮喘气道炎症中的作用

第二部分Serrate1基因真核表达载体转染小鼠树突状细胞及鉴定

第三部分 超表达Serrate1树突状细胞对CD4+CD25+T细胞极化的影响

参考文献

全文结论

临床意义

致谢

照片

文献综述一 调节性T细胞在变应性气道疾病中的作用

文献综述二 树突状细胞在调节性T细胞分化中的作用

攻读博士学位期间发表文章