细菌FimH蛋白在ANCA相关性血管炎中的作用及机制研究

摘要

背景与目的:　　抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是自身免疫性系统性小血管炎(Small vessel vasculitis,SVV),因循环中存在 ANCA包括髓过氧化物酶抗体(myeloperoxidase, MPO)和蛋白酶3抗体(protease3,PR3)而命名,肾脏病理主要表现为局灶坏死性肾小球肾炎(focal necrotizing glomerulonephritis,FNGN),伴新月体形成,病情进展凶险,通常导致快速进展的肾功能衰竭,愈后很差。人溶酶体膜蛋白-2(human lysosomal membrane proteins2,hLAMP-2)抗体是新近由Kain等报道的一种ANCA新亚型,与肾脏损伤高度相关,其由细菌鞭毛FimH蛋白通过“分子模拟”(Molecular Mimicry, MM)机制致病,即革兰氏阴性杆菌的鞭毛蛋白第72至80位氨基酸残基多肽(FimH P72-80)与人LAMP-2第41至49位氨基酸残基多肽(LAMP-2 P41-49)具有100％同源性,导致机体识别病原体FimH抗原产生的免疫应答,也直接作用于自身抗原LAMP-2蛋白,导致小血管及肾脏的坏死性病变。提示细菌入侵人体后,通过 FimH启动针对LAMP-2的自身免疫是ANCA相关性FNGN发病机制的关键。　　不同于Th1细胞与Th2细胞,Th17细胞是新型的CD4+辅助性T细胞(T helper, Th)亚群,通过分泌白介素-17(interleukin-17,IL-17)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子,参与机体重要生理或病理进程。Nogueira等研究发现,急性期AAV患者血清IL-17A水平显著升高,肾组织上可见IL-17大量表达,血清IL-23及MPO和PR3特异性的Th17细胞数均增高,提示IL-17在AAV的发生中起重要作用。无论在 ANCA阳性的血管炎患者,还是血管炎小鼠模型,均存在MPO-ANCA或PR3-ANCA特异性的Th17细胞克隆及反应,提示Th17细胞可能参与了ANCA相关的病理损伤。然而,细菌感染后如何激活宿主自身免疫,具体机制需要进一步探索。含鞭毛蛋白(FimH)的细菌感染后,IL-17变化情况及其与肾脏损伤是否相关,目前还未见报道。　　LAMP-2抗体的发现被认为开创了继传统ANCA的又一个新纪元,但是否能成为临床诊断 AAV的血清学标志目前还存在争议,其敏感性和特异性还需进一步验证。本研究拟从临床出发,通过诊断性试验研究设计,探讨LAMP-2抗体在本单中心对AAV的诊断价值;同时从发病机制出发,构建FimH融合蛋白表达载体并纯化,联合Titermax Gold佐剂,皮下免疫WKY大鼠,初步观察大鼠肾小球损伤及血清IL-17A水平、与蛋白尿相关性等,进一步探讨感染与AAV自身免疫的可能机制。　　方法:　　1. LAMP-2抗体在AAV中临床价值评价按改进的美国 Chapel Hill血管炎会议(CHCC)诊断标准,筛选2010年09月至2013年06月,就诊于第三军医大学新桥医院肾内科的AAV新月体肾炎患者32例,其中28例肾活检明确为新月体肾炎,以ANCA阴性其他肾小球肾炎42例为病例对照组;50例健康志愿者,为健康对照组。入院后收集各组血清,以健康志愿者血清光密度(optical density,OD)值加2倍标准差(standard deviation,SD)作为参考值截止值(cut off值)。以重组人 LAMP-2/CD107b为包被抗原(R&D公司),间接ELISA法检测血清LAMP-2抗体。参照试剂盒说明,采用欧蒙印迹法及间接免疫荧光法检测 MPO、PR3及 GBM等(欧蒙医学诊断股份公司)。列出诊断性实验四格表,计算诊断评价指标:敏感度(sensitivity,Sen)、特异度(specificity, Spe)、阳性预测值(positive predictive value,PPV)、阳性似然比(positive likelihood ratio, PLR)、阴性预测值(negative predictive value, NPV)、阴性似然比(negative likelihood ratio, NLR)及约登指数(Youden index, YI)等。　　2. FimH1-156融合蛋白的制备 PCR法克隆pPKL241质粒获取FimH1-156基因,插入原核表达载体pET28a(+);将重组表达质粒转染感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达FimH融合蛋白,超声裂解细菌,Ni-NTA层析法进行纯化,SDS-PAGE分析、Western印迹法对其进行鉴定。LAMP-2表位肽P41-49的合成及鉴定由杭州中肽生物有限公司合成,并经质谱鉴定,纯度大于95%。　　3. FimH1-156融合蛋白及LAMP-2表位肽P41-49诱导的病理模型:融合蛋白模型组:采用纯化的大肠杆菌 FimH融合蛋白(150μg)联合 Titermax金佐剂(150μl)皮下注射免疫Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,融合蛋白对照组:采用PBS(150μl)+Titermax金佐剂(150μl)。多肽模型组:采用完全弗氏佐剂联合LAMP-2表位肽P41-49免疫WKY大鼠,在每只 WKY大鼠尾根部皮下注射600μl鸡尾酒式乳化液:内含300μl完全弗氏佐剂以及300μl双蒸水溶解的0.3mg LAMP-2多肽P41–49。多肽对照组:大鼠采用双蒸水代替多肽免疫大鼠。监测各时间点(0、3、7、14、21、28、35、50天)大鼠24小时尿蛋白总量的变化,于免疫后21天、35天和50天检测大鼠血清尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)水平,观察肾、肺组织病理变化,ELISA法检测血清IL-17A水平。　　结果:　　1.2010年9月至2013年6月期间,符合纳入标准的AAV新月体肾炎患者32例,其他肾小球肾炎42例。50名健康志愿者来自新桥医院健康体检中心。在32例AAV中,30例检出LAMP-2抗体阳性。而在42例疾病对照组中,7例检出阳性。其中ANCA阴性、其他自身抗体阴性的新月体肾炎检出LAMP-2抗体的4例。健康对照组无阳性抗体检出。列出诊断性实验四格表后,计算出其敏感度(Sen)、特异度(Spe)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)及约登指数(YI),分别为93.8%、83.3%、81.1%、94.6%、5.625、0.075和0.771。　　2.成功构建原核表达载体 pET28a-FimH1-156,经对融合蛋白表达条件的优化,在IPTG浓度为1 mmol/L诱导4h后,目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在;WB证实该FimH1-156融合蛋白可与抗6×His单克隆抗体发生反应。　　3.融合蛋白模型组的大鼠24小时尿蛋白总量在免疫后第3天开始升高,第7天、35天、50天时显著高于其对照组(p<0.05);免疫后50天,大鼠血清UREA、CREA、UA水平,均显著高于其对照组(p<0.05);免疫后35天,肾脏组织显示局灶坏死,免疫后50天新月体形成,肺泡壁增厚、部分断裂;免疫WKY大鼠35天后,血清IL-17A表达均显著高于其对照组(p<0.05); IL-17A与24小时尿蛋白之间存在明确相关性(R=0.5566,p=0.0210)。多肽模型组的大鼠在13天时24小时尿蛋白定量显著高于多肽对照组(P<0.05);肾脏损伤无明显特异性,可见系膜细胞增生、炎性细胞浸润,未见明显局灶坏死及新月体形成;IL-17A水平表达也显著高于多肽对照组(P<0.05)。　　结论:　　1. LAMP-2抗体对AAV所致新月体肾炎具有较好的诊断价值,并在ANCA阴性的新月体肾炎发现LAMP-2抗体,需进一步大样本验证。　　2.成功克隆 FimH1-156融合蛋白表达基因并构建至原核表达载体,获得了包涵体纯化的FimH1-156融合蛋白,为下一步建立实验动物肾损伤模型奠定了基础。　　3.细菌FimH融合蛋白诱导大鼠肾小球局灶坏死性损伤及肺损伤,IL-17A参与了FimH融合蛋白诱导的大鼠肺、肾损伤过程。

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第一章 前 言

1.1 选题缘由与研究背景

1.2 研究意义

1.3 研究内容及方法

第二章 溶酶体膜蛋白-2抗体在ANCA相关性血管炎中的临床诊断价值

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.4 讨论

第三章 细菌FimH蛋白在ANCA相关性血管炎的机制研究

3.1 FimH1-156融合基因的构建及其原核蛋白表达与纯化

3.2 FimH融合蛋白诱导大鼠肾小球局灶坏死性损伤的机制研究

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

攻读硕士期间的研究成果

致谢