毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库的构建及筛选

摘要

毛囊有许多有益的生物学功能,具有重要的心理社会学作用,脱发或多毛症会给患者带来沉重的精神负担甚至心理障碍.对毛囊生物学及病理学的深入研究对今后建立毛发疾病治疗的新方法具有指导意义.毛囊周期性进行以下阶段:器官生长和毛干形成(生长期)、器官退化(退行期)和相对的静止状态(休止期).毛囊高度发育的特性,特别是它所具有的周期生长能力,引起生物学专家的浓厚兴趣,毛囊的生长周期是凋亡和分化、毛囊周围蛋白水解和基质重建以及毛囊黑素合成高度协调的结果.毛囊上皮细胞与间质细胞即毛囊角质形成细胞与毛乳头细胞的相互作用调控着其生长周期.毛囊从休止期向生长期转换时,毛囊隆突部的干细胞在毛乳头细胞的作用下被激活增殖,此过程是一个独特的器官再生现象. 目前对生长期毛囊的研究主要集中在细胞因子、化学介质和炎性细胞浸润等方面,而对毛囊生长期基因的表达变化所知甚少.因为每个毛囊都有自己固有的生长节律,其生长周期是非同步的,所以研究毛囊周期的主要障碍是缺乏三个生长阶段的模型,特别是其生长期和休止期.许多证据表明斑秃是研究毛发生长周期的理想模型,斑秃的最早临床表现为休止期脱发,呈局限性离心性向外发展.Eckert 等认为斑秃发病过程是生长期毛囊成批的提前进入休止期造成的,在已形成的秃发斑中主要是休止期毛囊,说明毛囊向生长期发展的过程受到阻碍.因此,可将非斑秃区和斑秃区毛囊分别作为生长期和休止期毛囊模型,研究毛囊生长期的基因调控机制.通过对许多生物学过程中基因表达水平变化的研究,可有效揭示此过程的遗传学本质.检测正常组织和异常组织之间差异表达基因的方法有许多种,如差异显示技术(DD)、表达序列标签法(EST)、消减杂交法和基因表达的系列分析(SAGE),最近建立的微阵列技术更是引起人们浓厚兴趣,在人类疾病状态的研究中仍有很高应用前景.尽管如此,这些方法过程繁琐,需要昂贵的设备,而且需要大量mRNA,临床标本尤其是毛囊由于取材量少很难达到要求.最近的研究表明,在种类上,稀有mRNA(在细胞中少于5个拷贝)在整个转录子中占大多数,但在量上只占总转录子的一小部份,而少数高表达的基因是总转录子的主要组成部份.需要强调的是即使低表达丰度的基因也同样具有重要的生物学功能.一般认为在一个细胞中有大约2万个基因表达,应用SAGE或高密度微阵列的研究表明,在肿瘤与正常组织表达丰度变化超过10倍的基因只占mRNA种类的0.5~2﹪ . 本研究中,采用SMART cDNA合成技术合成的两组cDNA电泳条带非常相似,也说明两种状态的细胞mRNA差异非常小.抑制性消减杂交技术(uppression subtractive hybridization, SSH)可高度敏感的检测到低丰度的差异表达基因,因为它具有正常化(normalization)的作用,通过两次削减杂交和两次抑制性PCR使每种cDNA的量相对平衡,这样就避免了对高丰度基因的优先筛选,因此相对于传统的筛选方法可高度敏感的筛选低表达的基因,而且通过SSH还有可能发现新基因,同时SSH具有更强的可操作性,在很大程度上克服了假阳性高、工作量大的缺点.另外大量研究表明,采用SMART<'TM> cDNA 合成技术可从少量的RNA合成完整的cDNA文库,明显优于普通的RT-PCR.毛乳头细胞位于毛囊底部,它在毛囊形成、毛发生长和毛发周期转换中起关键作用.从Oliver的研究开始,毛乳头所固有的诱导毛囊形成的特性得到了多次证明.即使将体外培养的毛乳头细胞移植入正常皮肤,仍然具有诱导毛发生长作用.我们已建立了高效简便分离毛乳头细胞的方法,并用于毛发生长研究,为了进一步阐明毛发周期调控的分子机制,我们以斑秃作为模型,采用抑制性消减杂交技术及SMART cDNA合成技术筛选生长毛囊期毛乳头细胞的差异表达基因.由于Northern印迹需要大量的mRNA,不适用于小量的临床标本,所以本实验用反向Northern替代了Northern印迹,对所筛选的差异表达基因进行验证,此方法的特异性与Northern杂交接近,敏感性高于标准的Northern杂交.本实验的主要研究结果如下:(1)两步酶消化法是一种快速、简单、经济的分离培养毛乳头细胞的方法.我们针对斑秃区生长期毛囊及秃发区休止期毛囊的不同特点,对分离方法作了相应的改进,成功的分离到高纯度的生长期及休止期毛囊的毛乳头.(2)毛乳头细胞在毛囊周期中起关键作用,其基因表达水平的变化可能在毛发生长周期中起着重要作用.本研究中为了从斑秃的临床标本中筛选差异表达基因,我们以斑秃为模型,采用SSH和SMART cDNA 合成技术成功的建立了毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因文库.尽管在以往很多研究中采用SSH成功地从其它组织不同的病理状态下分离出了差异表达的基因,但本实验是第一次研究生长期毛乳头细胞基因表达变化.(3)通过测序和BLAST同源性搜索,共找到42个在生长期毛乳头细胞高表达的基因.这些克隆可分为:功能已知基因和功能未知基因.大多数功能已知基因按功能属于核酸合成、细胞周期和生长调节、蛋白合成、能量代谢、细胞角蛋白和染色体结构调节等相关的基因,其中包括17-β羟基类固醇脱氢酶、Dermatopontin、属于金属蛋白酶家族的ADAMTS4、核糖核酸酶/血管生成素抑制基因、钙调蛋白结合蛋白、Stanniocalcin-1等,另外还有14个功能未知基因.这些差异表达基因均通过反向Northern进行了验证,以上基因的发现对阐明毛发生长周期中分子遗传学调控机制具有重要意义,通过对基因文库的进一步筛选和研究有可能从中找到更多的毛发生长调控基因和生长期标志蛋白,并对今后建立毛发疾病治疗的新方法具有指导意义.总之,我们第一次建立了用SSH方法分离毛囊生长期毛乳头细胞差异表达基因的方法,证明SSH技术可用于小量的临床标本筛选未知的差异表达基因,所发现的差异表达基因对阐明毛发生长周期的基因调控和毛发疾病的治疗具有重要意义,但对这些差异表达的基因尤其是功能未知的基因在毛发生长中的确切生物学功能仍需进一步深入研究.

目录

英文缩写

前言

第一部分u3000毛乳头细胞的分离及总RNA提取

第二部分u3000生长期毛乳头细胞差异表达基因cDNA文库的构建

第三部分u3000毛囊生长相关基因的筛选、测序及同源性分析

全文结论

不足与展望

致谢

文献综述一毛囊形态发生的基因调控研究进展

文献综述二毛囊的分子遗传学

文献综述三细胞因子对毛囊形成及毛发周期的调节

攻读博士学位期间发表的文章

攻读博士学位期间申请的课题

参考文献