淡水瓦氏雅罗鱼基因文库的构建和抗冻蛋白基因同源序列的筛选

摘要

极地海域中的鱼类非常耐寒。它们的血液里常含有两种能降低其体内冰点的蛋白质：抗冻糖蛋白（AFGP）和不含糖的抗冻蛋白或抗冻多肽（AFP）。这些蛋白的编码基因已经被克隆，并将黄盖鲽AFP导人虹鳟鱼和大西洋鲑鱼，而改变了它们的抗冻基因进行了分离研究。所用实验材料鱼为中国内蒙古北部生活的瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii)，属鲤形目（Lypciniformes)，鲤科（Lyprinidae)，雅罗鱼亚科（Leucisinae)，基本按标准方法构建瓦氏雅罗鱼的基因文库。只在包装反应至30分钟时，再加一份BHB2690制备物，并延长30分钟反应时间。所得文库的成斑率大于1×105pfu。已知AFP基因常常多至40个拷贝，故已够用。采用通用的原位分子杂交和Southern分析进行瓦氏雅罗鱼AFP基因同源序列的分离及其亚克隆分析。以北美黄盖鲽AFP基因片段为探针，从瓦氏雅罗鱼DNA文库中筛选了三个阳性克隆。图一所示为其中一个的双份膜及其复筛结果。图二为这个阳性克隆DNSA经过三种限制酶切后，同时与北美黄盖鲽AFP基因片段和该基因0．4KbcDNA两种探针的southern分析结果。其中Sac酶切在两个杂交中的均能产生一条2．7Kb的杂交带。图三对两个阳性克隆的southern分析证明：对这个杂交片段的亚克隆是成功的。这是首次在中国一种耐寒淡水鱼基因组内发现并得到AFP基因同源序列，将用于转基因鱼的研究。