远志皂苷对Aβ1-40诱导的PC12细胞及大鼠痴呆模型保护作用机制的研究

摘要

老年性痴呆，亦称阿尔茨海默病(Alzheiner's disease，AD)，是一种以渐进性记忆认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，其中神经元大量丢失、胞外老年斑(SP)异常沉积及胞内神经原纤维缠结(NFTs)为其标志性的病理特征。AD是一种老年人群高发病率的疾病，随着年龄的增长，患病率也迅猛上升，但其具体的发病机制尚不清楚，现有的治疗方法并不能彻底地除病根，因此需要深入探究AD的发病机制和新一代抗痴呆药物的作用机制，为临床治疗AD提供有效的药物。
　　目的：⑴研究Aβ1-40对PC12细胞中细胞凋亡、Tau蛋白的磷酸化、UPP通路的影响及远志皂苷的保护作用。⑵研究Aβ1-40对大鼠学习记忆能力、脑神经细胞凋亡、UPP通路的影响及远志皂苷的保护作用。
　　方法：①在培养的PC12细胞中，加入Aβ1-4025μmol·L-1建立细胞损伤模型，并以远志皂苷50，100和200μmol.L-1干预治疗24 h，免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3)、Tau蛋白及磷酸化Tau(p-Ser396)、调控Tau的蛋白激酶PKA及蛋白磷酸酯酶PP-2A及UPP通路相关蛋白（泛素化蛋白）的表达情况;ELISA法检测PC12细胞中26S蛋白酶体含量变化。②大鼠脑内右侧海马区注射Aβ1-40以建立AD大鼠模型，并以远志皂苷（18.5，37，74 mg/kg）灌胃治疗30 d，利用Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力;流式细胞术检测各组大鼠脑神经细胞凋亡率;RT-PCR法检测各组大鼠脑神经细胞凋亡相关基因（bcl-2、bax、cyt-c、caspase-9、caspase-3）表达的变化;ELISA法检测大鼠脑组织中26S蛋白酶体含量变化;免疫组织化学法检测Aβ蛋白的表达情况;免疫印迹法检测Tau(p-Ser396)及泛素化蛋白的表达情况。
　　结果：⑴体外实验中，与正常对照组相比，模型组中Cyt-C、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白含量显著增加，Bcl-2蛋白含量明显减少(P＜0.01);当加入远志皂苷干预24 h后，与模型组相比，远志皂苷各剂量组中Bax、Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白含量有所下降，Bcl-2蛋白含量明显增加(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。⑵体外实验中，与正常对照组相比，模型组中PKA、Tau(p-Ser396)及总Tau蛋白的含量显著增加，而PP-2A含量显著下降(P＜0.01);经远志皂苷干预24h后，与模型组相比，远志皂苷各剂量组中PKA、Tau(p-Ser396)及总Tau蛋白有所下降，PP-2A含量明显上升(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。⑶体外实验中，与正常对照组相比，模型组中26S蛋白酶体含量明显下降，泛素化蛋白及Tau(p-Ser396)含量显著增加(P＜0.01);经远志皂苷干预24 h后，与模型组相比，远志皂苷各剂量组中26S蛋白酶体含量有所增加，泛素化蛋白及Tau(p-Ser396)含量明显下降(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。⑷体内实验中，与正常对照组相比，模型组中大鼠的逃逸潜伏期明显延长，游泳路程显著增加，穿越平台次数明显下降（P＜0.01）;经远志皂苷灌胃治疗30d后，与模型组相比，TEN中高剂量组大鼠逃逸潜伏期明显缩短，游泳路程显著降低，穿越平台次数明显上升(P＜0.05、P＜0.01)，而TEN低剂量组差异明显（P＞0.05）。⑸体内实验中，与正常对照组相比，模型组中大鼠脑神经细胞凋亡率显著上升， bax、cyt-C、caspase-9及caspase-3 mRNA表达明显增加，bcl-2 mRNA表达显著下降(P＜0.01);经远志皂菅灌胃治疗30d后，与模型组相比，各组大鼠脑神经细胞凋亡率明显降低，bax、cyt-C、caspase-9及caspase-3 mRNA表达有所下降，bcl-2 mRNA表达明显增加(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。⑹体内实验中，与对照组相比，模型组中大鼠脑神经细胞中26S蛋白酶体含量显著下降，泛素化蛋白、Aβ蛋白及Tau(p-Ser396)的表达明显增加(P＜0.01);经远志皂苷灌胃治疗30d后，与模型组相比，各组大鼠脑神经细胞中26S蛋白酶体含量明显增加，泛素化蛋白、Aβ蛋白及Tau(p-Ser396)的表达有所下降(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。
　　结论：①体外实验中，远志皂苷可能通过下调Bax上调Bcl-2的表达，改变线粒体膜的通透性，阻止Cyt-C向胞质中外泄，防止Caspase-9及Caspase-3酶原被激活，从而抑制了细胞凋亡的发生，减轻Aβ1-40对PC12细胞毒害作用。②体外实验中，远志皂苷可通过调控PP-2A与PKA的表达，降低神经细胞中总Tau蛋白含量，恢复Tau蛋白的低磷酸化水平，进而达到对Aβ1-40诱导的神经细胞的保护作用。③体外实验中，远志皂苷可在一定程度上解除Aβ1-40对神经细胞中的26S蛋白酶体表达的抑制作用，促进泛素化蛋白及磷酸化的Tau蛋白的降解，减轻Aβ1-40对UPP通路的毒害作用。④体内试验中，远志皂苷可在一定程度上提高AD大鼠学习记忆能力，减轻Aβ1-40对脑神经细胞产生的毒害作用。⑤体内试验中，远志皂苷可通过上调bcl-2 mRNA下调bax mRNA的表达，改变线粒体膜通透性，减少cyt-c mRNA在胞质内表达，阻止caspase-9 mRNA及caspase-3 mRNA的表达，进而减少脑神经细胞的线粒体途径凋亡的发生。⑥体内试验中，远志皂苷可通过提高脑神经细胞中26S蛋白酶体的含量，促进泛素化蛋白、Aβ蛋白及磷酸化的Tau蛋白的降解，进而保护UPP这条降解通路。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 远志皂苷对Aβ1-40诱导PC12细胞损伤的保护作用机制研究

一、远志皂苷对Aβ1-40损伤的PC12细胞凋亡的改善作用

1．材料

2．方法

3．结果与分析

4 讨论

二、远志皂苷对Aβ1-40损伤的PC12细胞中Tau蛋白磷酸化的影响

1 材料

2．方法

3．结果与分析

4 讨论

三、远志皂苷对Aβ1-40诱导的PC12细胞中UPP通路的影响

1．材料

2．方法

3．结果与分析

4 讨论

第二部分 远志皂苷对Aβ1-40诱导的痴呆大鼠模型保护作用机制的探讨

一、远志皂苷对AD大鼠认知功能障碍的影响

1．材料

2．方法

3．结果与分析

4 讨论

二、远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

三、远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞中UPP信号通路的影响

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

总结

一、结论

二、创新点

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

个人简历

致谢