苜蓿中华根瘤菌中ActS/ActR双组份系统酸调节基因的功能分析

摘要

生物固氮为生物界的生物提供了大约有3/4的氮源。生物固氮是固氮微生物通过利用固氮酶将大气中的氮其直接转化为能被生物相互之间吸收利用的氨的过程，不会消耗大量能源也不会对生态环境造成破坏与污染。对环境的保护以及对农业生态的可持续发展是十分有利的。其中在生物固氮中效率是最高的当属共生固氮。
　　共生固氮是固氮微生物和宿主植物之间长时间互利共生、相互作用、协同进化的结果。在结瘤固氮的过程中，宿主植物生长代谢所需的氮源由固氮微生物所提供，而固氮微生物生命代谢必需的碳源由宿主植物则来提供，同时宿主植物也为固氮微生物提供生长繁殖的场所，根瘤。
　　根瘤菌——与豆科宿主植物的共生相互作用具有专一性，即一种根瘤菌只能与特定的豆科宿主植物相互作用结瘤固氮。根瘤菌与豆科宿主植物之间的共生固氮是一个十分复杂的生物学过程，涉及到二者之间分子信号的识别、传递与交换。这一过程是由豆科植物和根瘤菌中的一系列基因所决定的。结瘤信号分子主要是豆科植物在种子的萌发和根的生长过程中产生的，主要的结瘤因子是类黄酮等，它们是激活根瘤菌结瘤调节基因产物，进而作用于结瘤基因的启动子区域，诱导结瘤基因的表达，控制新的信号分子（结瘤因子）的合成，同时结瘤因子作用于豆科宿主植物，诱导根部发生一系列形态变化和生理生化反应，启动宿主植物的结瘤过程。
　　双组份系统(two-component system，TCS)是一种信号传导元件，它在细菌中是普遍存在的，是细菌适应胞内生理变化和外部环境的主要调控系统。典型的双组份系统是由一个组氨酸激酶(Histidine kinase，HK)和一个反应调节蛋白(Response regulator, RR)构成的。组氨酸激酶负责感受胞内外刺激，自磷酸化，然后将磷酸基团传递给反应调节蛋白，从而调控下游相关基因表达。组氨酸激酶主要由信号感受结构域、二聚化及组氨酸磷酸转移结构域(DHp)和ATP结合及催化结构域(CA)组成，后两个结构域含有保守的N、H、F、G1和G2盒(box)。反应调节蛋白一般由一个效应结构域和一个接受结构域（REC）组成。
　　目前酸性土壤占了世界土地的四分之一，土壤严重酸化影响了植物与土壤微生物的生存以及宿主植物与土壤微生物之间的相互作用。其中土壤中的根瘤菌与其宿主豆科植物共生固氮也受到了严重的影响，影响了根瘤菌对N2的固定，进而影响了农业系统中N输入。在某些情况下，根瘤细菌代表了共生关系中酸敏感组份;苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)对酸度特别敏感。这就产生了一个问题，根瘤菌靠什么机制来适应酸性环境，为什么有些根瘤菌对酸耐受有些根瘤菌对酸敏感？
　　目的: 1.确定苜蓿中华根瘤菌ActS/ActR双组份系统基因是否参与根瘤菌的酸调节以及在共生固氮体系形成过程中是否发挥作用。2.探究苜蓿中华根瘤菌ActS/ActR双组份系统参与基因调控的下游的转录因子及信号转导通路。
　　方法: 利用细菌中存在同源重组系统，将目标基因或其旁侧片段克隆至自杀性质粒上，通过三亲本接合转移，导入苜蓿中华根瘤菌，经过抗性筛选，噬菌体转导或者蔗糖敏感筛选获得质粒插入或者缺失突变体，利用点突变的方法将ActS/ActR双组份系统上的磷酸化位点突变成别的氨基酸获得了点突变菌株，然后进行自生（酸敏感性）和共生表型（结瘤和竞争结瘤）分析。
　　结果: 我们无法通过基因敲除方法获得这两个基因的缺失突变体。但是我们成功的构建了一个actR的插入突变体，利用点突变的方法获得了actS的点突变以及actS/actR的双突变，突变体对酸性的环境都是敏感的。进一步的研究发现，actR的插入突变体虽然可以诱导宿主植物紫花苜蓿形成固氮根瘤，但是其竞争结瘤能力与野生型菌株相比是明显将低的。
　　结论: ActS/ActR双组份系统除了可以调节苜蓿中华根瘤菌对酸性环境的适应性，还是该细菌存活所必需的，并且影响其在宿主植物上的竞争结瘤能力及共生固氮过程。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

2．1 材料和试剂

2．1．1 本实验所使用的菌株和质粒

2．1．2 PCR引物

2．1．3 RT-PCR引物

2．1．4 培养基和抗生素

2．2 方法

2．2．1 质粒制备及纯化

2．2．2 DNA片段的纯化回收

2．2．3 细菌基因组的提取

2．2．4 工具酶的使用

2．2．5 三亲本接合转移实验

2．2．6 噬菌体转导实验

2．2．7 点突变重组质粒的构建

2．2．8 插入突变重组质粒的构建

2．2．9 在actSH219A点突变的背景下构建actS／actR的双突变

2．2．10 细菌双杂交实验

2．2．11 菌落转移滤波器分析(Colony-lift Fnter Assay)

2．2．12 酸敏感实验

2．2．13 过氧化物敏感性实验

2．2．14 共生固氮实验与竞争结瘤实验

2．2．15 细菌RNA的提取方法

结果

3．1 细菌双杂实验

3．2 酸敏感实验

3．3 过氧化物敏感性实验

3．4 共生固氮实验

3．5 actR19的竞争结瘤能力分析

3．6 双组份系统ActS／ActR相关突变体基因表达的分析

讨论

结论与创新点

发表论文

致谢

参考文献