苜蓿中华根瘤菌中参与丙二酸代谢的matPQMAB操纵子的研究

摘要

TRAP转运体是一类依赖胞外溶质受体（ESR）特异性吸收胞外游离溶质的二级主动转运系统。该转运体通过离子电化学梯度而不是ATP水解为溶质运输提供能量，广泛存在于细菌和古生菌等原核生物中。TRAP转运体是一种新型的溶质转运系统，主要由三个部分组成，即一个吸收胞外溶质的ESR和两个大小不同的内膜蛋白。 本文研究了苜蓿中华根瘤菌 Rm1021中matPQMAB基因簇的功能及其表达调控。通过生物信息学分析S.meliloti Rm1021基因组序列，发现在共生大质粒A（pSymA）上含有四个连续的基因SMa0157、SMa0155、SMa0151、SMa0150，它们构成一个操纵子，可能编码一个丙二酸盐TRAP转运系统，分别命名为matP、matQ、matMA、matB。在该操纵子的下游有一个转录调控因子GtrA，可能调节matPQMAB操纵子的表达。为了验证matPQMAB操纵子编码丙二酸盐TRAP转运体并受GtrA表达调控，我们构建了gtrA、matP、matQ、matMA、matB的质粒插入突变体，并进行了自生和共生表型分析。在以丙二酸盐为唯一碳源的基本培养基中野生型Rm1021能正常生长，而matP、matQ、matMA、matB突变体不能生长，说明matPQMAB操纵子编码一个丙二酸盐转运系统，并且是唯一转运途径。gtrA突变体在相同培养条件下生长略微缓慢。此外，gtrA突变体接种宿主植物紫花苜蓿，结瘤固氮效率低下。通过凝胶阻滞实验初步结果发现，GtrA蛋白能够与matPQMAB操纵子的启动子区域直接结合，说明GtrA直接调节matPQMAB操纵子的表达。本文对matPQMAB操纵子的matB基因产物的功能进行了分析研究。从Rm1021基因组中克隆出matB基因，并在大肠杆菌中进行了体外诱导表达和纯化。纯化的MatB蛋白具有丙二酸单酰辅酶A合成酶的活性，测定的Km值是710μmoL，Vmax是0.209μmoL/min/mg。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章细菌中TRAP转运系统的研究进展

1.1引言

1.2 TRAP的含义

1.3 ESR的含义和功能

1.4 TRAP转运体的功能特征

1.5 TRAP转运体的转运机制

1.6 TRAP转运体基因结构和亚基组成的多样性

1.7 TRAP转运体的组成

1.8其它相关的TRAP转运体

1.9结论

1.10本课题的研究意义

第二章GtrA调控matPQMAB操纵子的研究

1材料与方法

1.1植株材料

1.2菌株

1.3培养基、抗生素及菌体的培养

1.4酶及生化试剂：

1.5质粒制备及转化

1.6 DNA片段的纯化回收(参照北京博大泰克生物基因技术公司B型小量DNA快速胶回收试剂盒)

1.7固氮酶活的测定

1.8竞争结瘤试验

1.9生长曲线的测定

1.10三亲本结合转移实验

1.11噬菌体转导实验

1.12蛋白表达载体的诱导表达和纯化

1.13 Ni-NTA树脂的再生

1.14凝胶阻滞实验：(参照DIG Gel Shift Kit试剂盒说明书)

2结果与讨论

2.1gtrA与matPQMAB基因簇序列分析

2.2突变体的构建(尉爱远构建)

2.3gtrA与matPQMAB操纵子对共生的影响

2.4竞争性结瘤实验

2.5 matPQMAB操纵子参与丙二酸盐的吸收和利用

2.6凝胶阻滞实验

3本章小结

第三章matPQMAB操纵子中部分基因的功能研究

1材料与方法

1.1菌株和质粒

1.2培养基、抗生素及菌体的培养

1.3 MatB与MatA蛋白的诱导表达与纯化浓缩

1.4 MatB蛋白酶活力单位的测定

1.5 MatB的米氏常数(km)和最大反应速率(Vmax)的测定

2结果与分析

2.1 MatB表达蛋白的检测

2.2 MatB表达蛋白的纯化与浓缩

2.3 MatB蛋白的酶活性检测

2.4 MatA蛋白的纯化与浓缩

3讨论

总结与展望

参考文献：

附录

致谢

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