基于CRISPR/Cas9技术的HeLa细胞全基因组敲除文库的建立及初步应用

目录

声明

主要符号对照表

第一章 绪论

1.1 CRISPR/Cas系统

1.1.1 CRISPR/Cas系统的由来

1.1.2 CRISPR/Cas系统的分类

1.1.3 CRISPR/Cas9系统的构成及工作原理

1.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术

1.2.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术工作原理

1.2.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用

1.3 CRISPR/Cas9介导的全基因组筛选技术

1.3.1 CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库建立流程

1.3.2 CRISPR/Cas9介导的全基因组筛选研究进展

1.3.3 CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库筛选HIV宿主因子的主要研究进展

1.4 研究目的与意义

第二章 稳定表达Cas9单克隆HeLa细胞系的建立

2.1 材料和方法

2.1.1 质粒和细胞

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 慢病毒制备

2.1.5 慢病毒滴度测定

2.1.6 潮霉素最适工作浓度的确定

2.1.7 Cas9多克隆细胞的筛选

2.1.8 Cas9单克隆细胞的筛选与Western blot鉴定

2.1.9 嘌呤霉素最适工作条件的确定

2.1.10 基因敲除效率的检测

2.1.11 细胞活性的测定

2.1.12 Cas9单克隆细胞系二次单克隆化

2.2 结果

2.2.1 稳定表达Cas9蛋白的HeLa单克隆细胞系的建立与鉴定

2.2.2 Cas9蛋白基因敲除效率检测

2.2.3 稳定表达Cas9蛋白对HeLa细胞活性的影响

2.3 小结

第三章 sgRNA文库的扩增

3.1 材料和方法

3.1.1 质粒、菌株和细胞

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.1.4 质粒电转

3.1.5 质粒提取

3.1.6 高通量测序

3.2 结果

3.2.1 GeCKO文库扩增

3.2.2 高通量测序结果

3.3 小结

第四章 敲除细胞文库的建立

4.1 材料和方法

4.1.1 质粒和细胞

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.1.4 引物

4.1.5 GeCKO文库（A库）慢病毒的制备

4.1.6 嘌呤霉素最适工作浓度的确定

4.1.7 GeCKO文库（A库）慢病毒滴度测定

4.1.8 敲除细胞文库的筛选

4.1.9 基因组提取

4.1.10 sgRNA文库扩增

4.1.11 PCR产物纯化

4.1.12 建库和高通量测序

4.1.13 DNA质量检测

4.2 结果

4.2.1 GeCKO文库（A库）慢病毒滴度测定

4.2.2 文库细胞的制备

4.2.3 sgRNAs扩增结果

4.2.4 文库细胞测序结果分析

4.3 小结

第五章 HeLa-GeCKO敲除细胞文库的初步应用

5.1材料和方法

5.1.1 质粒和细胞

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器

5.1.4 HIV-GFP慢病毒包装

5.1.5 HIV-GFP慢病毒滴度的测定

5.1.6 目的细胞的筛选

5.2结果

5.2.1 HIV-GFP慢病毒滴度的测定

5.2.2 目的细胞的筛选

5.3小结

第六章 讨论

第七章 全文结论

参考文献

致 谢

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