新型血清小RNA的发现及其在机体活动性感染中的研究

摘要

近年来，血清microRNAs(miRNAs)的发现开拓了一个全新的研究领域，其在不同疾病中的动态变化使其成一种新型的疾病检测分子标志，为癌症、代谢性疾病的诊断开创了一种革命性的无创检测方法。血清中含有大量的核酸酶，能够降解各种核酸。miRNAs在血清中或被微泡(exosomes)包裹或与血清蛋白复合物结合从而不受血清核酸酶的影响而稳定存在。然而，除miRNAs之外，血清中是否还存在其他形式的小RNA却尚未知晓。
　　转运RNA(tRNA)作为一种古老的RNA广泛的存在于整个生物王国，活化后的氨酰tRNA能够将所携带的氨基酸准确的转运到正在合成的多肽链上，在遗传信息翻译的过程中发挥着重要的作用。但是除了识别mRNA上的密码子转运氨基酸外，对于tRNA的其他功能的研究却不是很清楚。目前已有研究表明，细胞在各种应激条件下能够诱导前体tRNA及成熟tRNA特定位点进行特异性切割，从而产生一系列不同种类和片段长度的小RNA。然而前人对于tRNA来源的小RNA的研究主要集中于细胞在各种应激条件下的应答反应，对于生理条件下机体是否含有tRNA来源的小RNA却无从知晓。我们实验室曾于2012年首次在正常生理状况下发现一类来源于成熟tRNA序列5'端的新型小RNA(tRNA derivedsmall RNAs即tsRNAs)在哺乳动物成熟精子中高度富集，随后我们针对这类小RNA进行了更全面的检测和分析。
　　本实验通过对小鼠各个组织（大脑、卵巢、子宫、脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓）、全血、血清以及大鼠血清和食蟹猴血清中小RNA深度测序分析发现，tsRNAs在小鼠、大鼠和食蟹猴血清中呈现高度富集。我们进一步通过PCR及其产物测序发现，tsRNAs在各种脊椎动物（鱼、爪蟾、乌龟、鸽子和人）的血清中广泛大量存在，且在所检测的物种中tsRNAs的序列显示出高度的进化保守性，提示其作为一种古老的小RNA广泛保守地存在于动物血清中。通过荧光实时定量PCR实验发现，tsRNAs在血清中具有很高的稳定性，其游离子微泡(exosomes)外，通过与＞100kDa的蛋白复合体结合的形式而存在。tsRNAs在血清中的稳定机制至少涉及两个方面，一方面tsRNAs通过与血清蛋白结合形成复合体，使其免受血清核酸酶的水解;另一方面tsRNAs上的核苷酸修饰(可能来源于其前体tRNA)也为其抵御血清RNA酶的降解发挥了重要作用。
　　研究结果表明在正常的生理状况下，tsRNAs稳定、大量、保守地存在于各种脊椎动物的血液循环系统中。为了探究其生理意义，我们构建了内毒素(LPS)诱导的急性炎症模型。发现血清中的两种tsRNAs(tsRNAGly和tsRNAGlu)在LPS诱发的小鼠和食蟹猴急性炎症模型中呈现显著的上升，并伴随机体炎症的消退迅速下降，提示血清tsRNAs可能参与了机体炎症的反应过程。此外，我们又以乙肝患者为研究对象，通过对人类血清的检测发现，这两种tsRNAs在活动性乙肝患者（HBV病毒复制活跃期）血清中的含量相对于健康对照组显著升高，而在HBV病毒复制静息期患者中则无明显上升。以上研究结果提示血清tsRNAs可能参与了机体活动性感染引发的防御机制。
　　tsRNAs在血清中广泛、大量、保守、稳定地存在及其与疾病的密切关联提示其在临床生物诊断方面的应用潜能，为未来血清小RNA的功能及临床诊断研究开拓了一个新视角，具有广阔的研究空间和应用前景。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 引言

1．1 循环miRNA的研究进展

1．1．1 miRNA的简介

1．1．2 血清miRNA的发现

1．1．3 循环miRNA的生化特征

1．1．4 循环miRNA的来源及分泌机制

1．1．5 循环miRNA在受体细胞中的作用

1．1．6 细胞外miRNA的功能研究

1．2 tRNA来源的小RNA的研究

1．2．1．转运RNA的简介

1．2．2．转运RNA的功能

1．2．3．tRNA来源的小RNA

1．2．4 tsRNAs的产生原因

第二章 材料和方法

2．1 实验试剂与主要仪器

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1．实验动物

2．2．2．实验方法

第三章 结果

3．1 血清中存在大量的小RNA

3．2 小鼠血清小RNA片段的分布模式

3．3 大鼠和猴子的血清中含有大量tsRNAs

3．4 血清tsRNAs的分布具有偏好性

3．5 tsRNAs在各种脊椎动物的血清中保守存在

3．6 tsRNAs在血清中具有高度的稳定性

3．7 血清tsRNAs游离于微泡外

3．8 血清tsRNAs与＞100kDa的蛋白复合物结合

3．9 蛋白酶K处理不影响血清tsRNAs的稳定性

3．10 血清tsRNAs的稳定性与其自身的修饰有关

3．11 急性炎症模型中血清tsRNAs表达上升

3．12 乙肝病人血清中tsRNAs表达升高

第四章 讨论

4．1 血清tsRNAs的产生

4．2 血清tsRNAs的存在形式

4．3 血清tsRNAs的功能探讨

4．4 面临的困难

结论

参考文献

致谢

附录 攻读学位期间发表的学术论文目录