辐照捻转血矛线虫外泌体诱导羊免疫应答的初步研究

摘要

捻转血矛线虫是一种危害极大的牛羊胃肠道寄生虫，常常导致羔羊贫血死亡，造成巨大的经济损失。长期以来对该寄生虫病的防控主要采用以药物治疗为主的措施。随着耐药虫株和兽药残留等问题的日益严重，迫切需要采用免疫预防来控制捻转血矛线虫病。尽管在抗捻转血矛线虫的疫苗研发上取得了一定的进展，但迄今尚无一种可应用于现场的疫苗被研发成功。究其原因可能是我们对捻转血矛线虫感染和免疫的机理的了解仍不十分清楚，特别是对于来源于虫体的保护性组分（细胞或抗原）及其免疫生物学特性缺乏全面了解，故而制约了高保护性疫苗研发的进程。因此，有必要进一步开展新的高保护性免疫原的筛选和鉴定工作。以前的研究显示，用辐照捻转血矛线虫幼虫免疫羊后能诱导其产生对攻击感染的高保护性应答，而正常的捻转血矛线虫幼虫感染羊后几乎不能引起宿主的免疫保护。因此，辐照幼虫苗成为研究宿主高保护性免疫机制的理想模型。我们最近的研究显示，来源于体外培养的正常和辐照幼虫分别呈现出正常凋亡和免疫原性细胞死亡的表型，提示源于辐照和正常幼虫的细胞份子具有不同的免疫生物学特性。但其细胞和分子机制尚不十分清楚。外泌体是一种30-100nm的具有独特结构的囊泡，包含有蛋白和RNA等，具有细胞间传递信息和免疫相关功能。最近的研究表明，源于寄生原虫和线虫的外泌体对宿主的先天免疫具有抑制作用，蠕虫的排泄分泌物也常常具有抑制宿主免疫应答的功能特征。而包括线虫和吸虫在内的辐照蠕虫则能诱导宿主产生较强的保护性免疫应答。提示源于正常和辐照蠕虫幼虫的外泌体的分子构成及其免疫功能很可能存在差异。因此，我们推测，辐照和正常捻转血矛线虫外泌体的分子组分及其表达分布等可能存在差别，这种差异可能导致其具有不同的免疫生物学功能。但这一假说仍然需要我们用实验来进行验证。因此我们开展了辐照和正常捻转血矛线虫外泌体的分离鉴定及其免疫生物学功能测定的初步研究工作。　　本研究通过收集正常和辐照的18d捻转血矛线虫虫体体外培养12h的上清，经超滤浓缩，并使用外泌体分离试剂盒分离外泌体后，用透射电子显微镜鉴定外泌体形态，结果表明我们成功获得了外泌体。对上述两组虫体外泌体进行了Label free蛋白质组定量分析，结果发现辐照组来源外泌体高表达HSP70、HSP90和CRT等危险相关分子(danger-associated molecular patterns，DAMPs)。体外分别用5μg、20μg两个浓度外泌体刺激羊PBMC细胞后，结果辐照捻转血矛线虫外泌体能够刺激羊的PBMC上调IFNγ和IL-4等炎性细胞因子，抑制IL-10抗炎细胞因子和1L-17调节性细胞因子的表达，而正常组捻转血矛线虫则能够抑制IFNγ和IL-4等炎性细胞因子表达，上调IL-10抗炎细胞因子的表达量。正常捻转血矛线虫外泌体能够减少PBMC分泌NO，而辐照捻转血矛线虫外泌体则能够增加PBMC分泌NO。　　综上所述，本研究发现辐照后捻转血矛线虫外泌体内含有更多的DAMPs相关因子，且能够刺激宿主的炎症反应，而正常组捻转血矛线虫外泌体能够抑制宿主的炎症反应。提示来源于正常和辐照的捻转血矛线虫外泌体的组成和免疫相关功能存在差异。本研究为进一步阐明RA捻转血矛线虫疫苗引起宿主高保护性免疫应答的机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 捻转血矛线虫生物学概述

1．2 捻转血矛线虫病的防治

1．3 辐照致弱捻转血矛线虫疫苗研究现状与免疫机制

1．4 外泌体

第二章 捻转血矛线虫外泌体的分离纯化

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 捻转血矛线虫虫体获得

2．2．2 确定辐照组捻转血矛线虫辐照时间

2．2．3 辐照组和正常组捻转血矛线虫虫体外排泄分泌物的收集

2．2．4 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体收集

2．2．5 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体蛋白浓度测定

2．2．6 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体SDS-PAGE

2．2．7 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体透射电镜鉴定

2．3 实验结果

2．3．1 辐照组捻转血矛线虫辐照时间的确定

2．3．2 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体SDS-PAGE结果

2．3．3 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体透射电镜鉴定结果

2．4 讨论

第三章 辐照和正常捻转血矛线虫外泌体蛋白质组的比较分析

3．1 实验材料

3．1．1 实验主要试剂及仪器

3．2 实验方法

3．2．1 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体蛋白质组FASP酶解

3．3 实验结果

3．3．1 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体蛋白质组的总体分析

3．3．2 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体显著差异蛋白GO注释

3．3．3 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体显著差异蛋白KEGG pathway富集分析

3．3．4 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体差异蛋白DAMPs相关因子差异分析

3．4 讨论

第四章 辐照捻转血矛线虫外泌体对羊PBMC功能的影响

4．1 实验材料

4．1．1 实验主要试剂及仪器

4．1．2 实验动物

4．1．3 实验主要试剂配制

4．2 实验方法

4．2．1 外周血淋巴细胞的分离

4．2．2 总RNA抽提和RT-PCR

4．2．3 PBMC诱导型NO活性检测

4．3 实验结果

4．3．1 辐照组和正常组捻转血矛线虫外泌体对PBMC分泌NO的影响

4．3．2 RT-PCR检测PBMC上细胞因子mRNA转录水平的表达情况

4．4 讨论

第五章 全文总结

参考文献

致谢

作者简历