毕氏酵母中重组人白介素15的表达纯化及其生物学活性鉴定研究

摘要

白介素15（interleukin-15，IL-15）作为一种炎症因子，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-21一样同属4α超螺旋细胞因子家族。人源IL-15位于4号染色体短臂，含8个外显子和5个内含子，成熟IL-15编码114个氨基酸序列，分子量大小为14-15KDa，主要表达于单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞中。IL-15主要的生物学功能为诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK cell)的分化已及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。作为一种多效细胞因子，IL-15在免疫，肿瘤发生，过敏性反应及自身免疫疾病中均发挥着重要作用。
　　本文构建了一种C端带His标签和Myc标签的重组人白介素15(rhIL-15)的表达载体pPICZαA-Pro-hIL-15-Tag。重组表达载体经转化毕氏酵母表达菌株X-33后，阳性表达菌株rhIL-15表达产量高达75mg/L。X-33菌株表达的rhIL-15经镍离子亲和层析柱、DEAE阴离子交换柱纯化后纯度可达95％。毕氏酵母表达的重组白介素15存在不同程度的N-糖基化修饰形式，其分子量比预测理论分子量偏大。毕氏酵母中表达纯化的rhIL-15可促进小鼠CTLL-2及人NK细胞的增殖，具有良好的生物学活性。

目录

声明

摘要

第一章 研究背景

1．1 重组蛋白表达系统

1．1．1 大肠杆菌(Escherichia coli，E．coil)表达系统

1．1．2 酵母表达系统

1．1．3 丝状真菌表达系统

1．1．4 杆状病毒表达系统

1．1．5 哺乳动物细胞表达系统

1．1．6 植物表达系统

1．2 白介素15

1．2．1 白介素15(Interleukin 15)结构

1．2．2 白介素15信号通路

1．2．3 白介素15与肿瘤

1．2．4 白介素15的临床前研究

1．2．5 白介素15毒性

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 仪器

2．1．2 常规试剂及试剂盒

2．1．3 耗材

2．1．4 菌株及质粒

2．1．5 溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 毕氏酵母分泌型pPICZαA-Pro-rhIL-15-Tag表达载体构建

2．2．2 载体pPICZaA-Pro-rhIL-15-Tag转化毕氏酵母X-33菌株

2．2．3 白介素15多拷贝子高水平分泌表达酵母转化子的筛选

2．2．4 rhIL-15／X-33多拷贝酵母转化子的小量诱导表达

2．2．5 rhIL-15在摇瓶条件下的扩大表达

2．2．6 毕氏酵母表达上清中rhIL-15的纯化

2．2．7 肽指纹图谱分析及比对

2．2．8 rhIL-15的去糖基化

2．2．9 rhIL-15的生物学活性测定

第三章 结果与分析

3．1 重组白介素15表达载体pPICZαA-Pro-rhIL-15-Tag构建

3．2 重组白介素15高拷贝表达菌株筛选

3．3 rhIL-15／X-33表达菌株小量诱导表达

3．4 rhIL-15／X-33表达菌株大量诱导表达纯化

3．5 rhIL-15肽脂纹图谱分析

3．6 rhIL-15的去糖基化

3．7 rhIL-15的生物学活性测定

第四章 讨论

第五章 本文小结

附录

参考文献

致谢

在读期间(待)发表的学术论文与取得的其他研究成果