细菌V型分泌系统中BamA POTRA3-5BamB蛋白复合物结构和功能研究

摘要

细菌的分泌系统可以向细胞外分泌多种蛋白，来完成细胞本身的生理功能。目前，在革兰氏阴性细菌中已发现八种不同的分泌系统，即Ⅰ-Ⅷ型分泌系统。本论文主要对该细菌的Ⅴ型分泌系统的相关蛋白进行结构和功能研究。
　　蛋白酶、黏附素、致病因子等一些外膜蛋白通过Ⅴ型分泌系统分泌并整合到外膜上。这些外膜蛋白在Sec复合物的帮助下穿过细胞内膜到达周质空间，在这个过程中信号肽被切除，然后利用BAM复合物进行进一步折叠并分泌到外膜。
　　BAM复合物共包含五个蛋白，分别为BamA、BamB、BamC、BamD和BamE。BamA为细胞外膜蛋白，是BAM复合物的核心蛋白。BamB/C/D/E是四个脂蛋白:BamB/C/E不是细菌生存必须的蛋白，敲除任意基因仅仅会引起BAM复合物缺陷;BamD是细菌生存所必需的，敲除BamD基因会引起和敲除BamA基因相同的表型，细菌致死。
　　截止目前，BAM复合物的五个单体蛋白质结构和BamC-BamD亚复合物结构已被解析。BamA由两个结构域组成:C端是插入细菌细胞外膜的β桶结构域，N端是与多肽转运有关(POTRA，polypeptide-transport-associated)的五个结构域。依据生物信息学和生物化学分析，BamA的POTRA结构域提供了BamB/C/D/E结合支架:BamB和BamD与BamA直接结合，而BamC和BamE通过BamD间接结合到BamA上。
　　本课题主要关注的是BamA和BanB的相互作用。本文首先利用凝胶过滤层析法初步探索了BamA和BamB的相互作用，推测两者结合的区域是POTRA3domain。然后借助x射线晶体学方法，得到了2.1(A)高分辨率的BamAPOTRA3-4-BamB复合物结构，直接观察到BamA和BamB结合的区域是POTRA3 domain，最后通过Pull down和Western blotting实验，进一步确定了在溶液中BamA和BamB结合的位点也是POTRA3 domain。
　　本文通过对BamA POTRA3-4-BamB复合物结构的作用力分析，发现维持BamA和BamB相互作用的力主要是氢键和疏水作用。氢键和疏水作用区主要是由BamB中的DA、BC loops区的氨基酸和BamAPOTRA3的β1、β2、β3、β2-1oop-β3区的氨基酸参与形成。通过对BamB的氨基酸定点突变实验，确定了BamB中参与BamA与BamB相互作用的氨基酸。BamB中的R77、 E127、E150、S167和R195氨基酸是BamA-BamB相互作用所必须的，它们的突变型BamB完全丧失了与BamA结合的能力。同时Y60A、K128A和S193A突变型BamB与BamA结合的能力显著降低。通过对BamB氨基酸的保守性分析发现，参与BamA和BamB相互作用的氨基酸大多是保守的。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

第一章：引言

1．1 细菌的分泌系统

1．1．1 革兰氏阴性细菌和阳性细菌

1．1．2 革兰氏阴性细菌的分泌系统

1．2 Ⅴ型分泌系统的研究现状

1．2．1 Ⅴ型分泌系统的模型

1．2．2 Ⅴ型分泌系统的运输机制

1．2．3 Ⅴ型分泌系统中BAM复合物结构和功能简述

第二章：凝胶过滤层析法探索BamA-BamB的相互作用

2．1 凝胶过滤层析原理

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验菌株和载体

2．2．2 实验试剂和仪器

2．2．3 实验试剂配制

2．3 实验流程和方法

2．3．1 质粒扩增

2．3．2 目的蛋白的表达和纯化

2．4 实验结果和讨论

2．4．1 BamB、POTRA3-5、POTRA4-5单体蛋白纯化结果分析

2．4．2 初步探索POTRA3-5-BamB和POTRA4-5-BamB混合物的状态

第三章：X射线晶体学方法验证BamB与BamA POTRA3-5相互作用

3．1 蛋白结晶原理及方法

3．2 实验材料和方法

3．3 实验步骤和方法

3．3．1 BamB和POTRA3-5目的蛋白的表达和共纯化

3．3．2 BamB-POTRA3-5蛋白复合物晶体筛选

3．3．3 BamB-POTRA3-5蛋白复合物晶体优化

3．3．4 蛋白晶体X射线衍射数据收集和解析

3．4 BamB-POTRA3-4蛋白复合物晶体结构分析

3．4．1 BamB-POTRA3-4整体结构分析

3．4．2 结构比对

3．4．3 BamB-POTRA3-4相互作用力分析

第四章：Pull-down和Western blotting方法验证BamB和BamA的结合区域

4．1 实验材料和方法

4．1．1 实验菌株和载体

4．1．2 实验试剂和仪器

4．2 实验步骤和方法

4．2．1 pHGB．HA-POTRA4-5(266-420)质粒构建

4．2．2 目的蛋白表达纯化

4．2．3 Pull down和Western blot实验

4．3 实验结果分析

第五章：定点突变验证影响BamA-POTRA3和BamB相互作用的氨基酸

5．1 实验材料和方法

5．1．1 实验菌株

5．1．2 实验试剂和仪器

5．2 实验步骤和方法

5．2．1 定点突变质粒构建

5．2．2 突变蛋白的表达纯化

5．2．3 Pull-down和Western blotting实验步骤参考第三章

5．3 实验结果分析

结论

参考文献

图表目录

致谢

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