孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路在棉蚜生殖方式转换中的作用研究

摘要

棉蚜(Aphis gossypii Glover)是重要的农业害虫，在我国北方它能随季节的变化进行周期性的孤雌生殖和有性生殖，即春夏以孤雌蚜进行无性生殖而大量繁殖，秋天产生性母，进而产生性雌，与雄蚜交配产卵，以卵过冬。虽然棉蚜的全生活史及生殖型转换（或生殖可塑性）方式已经明了，但其中的分子机制一直不清楚。目前研究蚜虫生殖型转换的一个模式是豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum Harris)，与豌豆蚜不同，棉蚜有明显的性母并且转换寄主植物。之前我们实验室利用RNA-seq测定了棉蚜孤雌、性母、性雌三种生殖型的差异基因表达谱，通过GO聚类和KEGG通路分析富集出了光传导、孕酮介导的卵母细胞成熟、内分泌调节、以及表皮构成信号通路。
　　本论文选择孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路和光传导信号通路进行了初步研究。首先利用qRT-PCR对孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路中的bub1、ccna2、polo、plk1和mad2基因进行了表达验证，bub1、ccna2和polo在孤雌中的表达水平显著高于性母。通过注射dsRNA对bub1、ccna2和polo进行了初步的RNAi实验，发现bub1或ccna2 RNAi能够影响孤雌蚜的卵巢发育，但是否影响生殖型转换目前还不能确定。同时，也通过qRT-PCR测定了光传导信号通路中的ninac、opsin、arr2、GNB2、Trp和ANA基因从孤雌向性母转化过程中的时序表达模式，发现ninac、opsin、arr2和GNB2的表达水平在性母4龄若虫期显著上升。
　　棉蚜个体小、体壁薄、体液多，有关棉蚜RNAi的报道很少，尚没有注射和饲喂dsRNA的比较实验。本论文对注射和饲喂dsRNA进行了系统的比较研究，包括注射位点、注射剂量、饲喂剂量、组织摄取、干扰效率等，对注射和饲喂dsRNA的优缺点进行了讨论。实验结果表明，注射位点在中胸与后胸之间，注射剂量10ng，饲喂浓度400 ng/μl为宜。注射和饲喂的荧光(Cy3)标记siRNA都能够在卵巢和肠中检测到。

目录

声明

摘要

符号说明

一．引言

1．1 棉蚜概述

1．1．1 棉蚜的生活史

1．1．2 棉蚜的危害

1．2 RNA干扰研究进展

1．2．1 RNAi的发现

1．2．2 RNAi的作用机理

1．3 RNAi在昆虫中的研究

1．4 RNAi在昆虫中的应用

1．4．1 RNAi在昆虫基因功能研究中的应用

1．4．2 RNAi在有害昆虫治理中的应用

1．5 棉蚜生殖型转换机制研究

1．5．1 光周期对棉蚜生殖型转换的影响

1．5．2 蚜虫性别决定

1．5．3 孕酮等在生殖型转换中的作用

1．6 本课题的目的和意义

二．材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 棉蚜饲喂

2．1．2 用于转录组和表达谱测序的棉蚜样品的收集和处理

2．2 试验方法

2．2．1 基因组和表达谱检测

2．2．2 dsRNA合成

2．2．3 RNA提取与qRT-PCR

2．2．4 统计分析

2．2．5 注射方法RNA干扰

2．2．6 饲喂方法RNA干扰

2．2．7 siRNA在棉蚜中的定位

2．2．8 G0、G1、G2不同龄期样品收集

三．结果与分析

3．1 表达谱分析

3．2 生殖型转换机制初步研究

3．2．1 孕酮介导的卵母细胞成热信号通路研究

3．2．2 光传导信号通路研究

3．3 注射方法棉蚜RNAi研究

3．3．1 胸部注射不同量dsRNA棉蚜干扰效率

3．3．2 胸部Met dsRNA注射后干扰效果时间效应

3．3．3 胸部注射与腹部注射比较

3．4 饲喂方法棉蚜RNAi

3．4．1 饲料中色素选择

3．4．2 饲喂不同量dsRNA棉蚜干扰效率

3．5 siRNA在棉蚜体内分布

四．讨论

4．1 棉蚜不同生殖型表达谱分析

4．2 构建棉蚜中合适的干扰体系

4．3 Met在棉蚜生殖型转换机制研究中的作用

4．4 生殖型转换机制研究的下一步工作

五．结论

参考文献

附录

致谢