糖多孢红霉菌WB菌株及相关基因工程菌发酵工程研究

摘要

糖多孢红霉菌是工业上生产红霉素的放线菌，红霉素是临床上被广泛用于治疗革兰氏阳性细菌感染的广谱14-元大环内酯类抗生素，近年来红霉素产业在我国发展迅速，红霉素产量的提升和组分的改善主要取决于菌种自身的发酵能力、发酵工艺和发酵罐的工作能力。伴随着红霉素市场需求的日益增加，红霉素高产菌株筛选的步伐也在不断加快。基因工程改造筛选高产菌株是一种简捷的操作手段。TetR家族转录调节因子(TetR family transcriptional regulator, TFR)是最常见的原核转录调控家族之一，以其家族中结构和功能研究最为清楚的成员-四环素抗性阻遏蛋白(TeR Repressor, TetR)而命名。SACE3446基因是糖多孢红霉菌中普遍存在的可负调控红霉素生物合成的基因，而SACE_7301是糖多孢红霉菌中TetR家族转录调控子，其正调控红霉素产量，即它是一个正调控基因。
　　本研究以糖多孢红霉菌及其次级代谢产物红霉素为研究对象，利用实验室已构建并筛选获得的高产基因工程菌株，通过摇瓶发酵实验研究了其生产能力。采用5L小试发酵罐为主培养方法，分析验证了各种因素如:温度、pH值、搅拌桨层数、转速、接种量、种子龄等对糖多孢红霉菌WB菌株小试发酵过程中生长代谢的影响，利用以上单因素实验确定选取温度、接种量、种子龄三个因素做Box-Benhnken设计，且在Box-Benhnken设计中，温度、接种量、种子龄的选取范围也可以确定，以此做响应面优化试验，进一步确定了上述三个因素的范围。最终总结出一套较适合糖多孢红霉菌WB菌株的小试发酵工艺，并利用该工艺对基因工程菌株WB/3446和WB/3*7301进行小试发酵实验，总结了基因工程菌株与原始菌株小试发酵的异同，验证了基因工程菌株的生产能力。通过以上研究获得以下结果:基因工程菌株WB/3446和WB/3*7301摇瓶效价分别为973mg/L和862mg/L，较原始菌株WB分别提高了39.8％和33.6％。通过小试发酵实验分别确定了5L发酵罐的小试发酵工艺条件为:温度30℃、pH值7.0-7.2、搅拌桨2层、搅拌转速350 rpm、接种量20％、种子龄50 h左右、葡萄糖平均补入速率0.0076 g/min;响应面实验优化得出，温度31℃、接种量19.5％、种子龄49.5 h条件下WB菌株发酵水平为3210mg/L，且三次重复实验也验证了该结论的准确性。通过利用上述小试发酵工艺进行基因工程菌株小试发酵实验得出结果:WB/3446的红霉素A产量为4383 mg/L较原始菌株WB提高了35.1％，且基因工程菌株WB/3446菌丝体生长较WB菌株稍快，糖消耗量大，葡萄糖平均补加速率为0.0092 g/min，而WB菌株为0.0076 g/min。基因工程菌株WB/3*7301小试发酵结果得出红霉素A产量为4177mg/L相对于WB菌株提高了34.6％，且其菌丝体量在发酵的前期和WB菌株无明显差异，而在发酵的中后期基因工程菌WB/3*7301菌浓始终高于WB菌株，在发酵过程中还发现WB/3*7301菌株的糖消耗量始终高于WB菌株，其葡萄糖平均补入速率为0.0095g/min，但各个时期的葡萄糖补入速率略有差异。以上研究结果对实验室小试发酵的进一步开展和基因工程菌株的进一步放大实验研究具有重要的指导作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 前言

1．1 红霉素

1．1．1 红霉素的分子结构和理化性质

1．1．2 红霉素的生物合成

1．2 糖多孢红霉菌基因改造研究

1．3 糖多孢红霉菌小试发酵的生物反应器

1．4 国内外红霉素发酵现状

1．4．1 发酵培养基的优化研究

1．4．2 发酵过程和组分优化研究

1．5 本研究研究路线

1．6 本研究研究内容

1．7 本研究研究意义

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基及条件

2．1．3 缓冲液

2．1．4 仪器设备

2．1．5 试剂和原料

2．2 实验方法

2．2．1 糖多孢红霉菌发酵液的萃取

2．2．2 红霉素发酵液的HPLC分析

2．2．3 种子平板活化方法

2．2．4 5L发酵罐培养方法

2．2．5 发酵液中湿菌体浓度(PMV)的测定

2．2．6 发酵液中总糖还原糖检测方法

2．2．7 发酵液中氨基氮检测方法

2．2．8 小试发酵罐操作

第3章糖多孢红霉菌WB及其基因工程菌的摇瓶发酵

3．1 引言

3．2 结果与分析

3．2．1 WB菌株与WB／3446突变株红霉素A产量的HPLC检测

3．2．2 WB菌株与WB／3*7301突变株红霉素A产量的HPLC检测

3．3 小结

第4章 糖多孢红霉菌WB小试发酵工艺研究

4．1 引言

4．2 不同pH对WB菌株发酵的影响

4．3 不同温度对WB菌株发酵的影响

4．4 不同转速与搅拌桨层数对WB菌株发酵的影响

4．5 不同接种量对WB菌株发酵的影响

4．6 不同种子龄对WB菌株发酵的影响

4．7 响应面法优化WB菌株小试发酵工艺

4．7．1 Box-Behnken试验设计

4．7．2 响应面模型的建立和显著性检验

4．7．3 各因素的交互作用对红霉素A产量影响的响应面分析

4．7．4 优化糖多孢红霉菌WB小试发酵工艺参数

4．8 小结

第5章 基因工程菌WB／3446的小试发酵

5．1 引言

5．2 结果与分析

5．3 小结

第6章 基因工程茵WB／3*7301的小试发酵

6．1 引言

6．2 结果与分析

6．3 小结

第7章 总结

7．1 获得的主要结果

7．2 下一步研究计划

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文及专利