无序区段对疟原虫裂殖子表面蛋白2(MSP2)聚集和与膜相互作用的影响

摘要

疟疾是世界上最严重的传染性疾病之一，即使得疟疾的风险从20世纪的开始就大幅度的降低，但是每年仍有上百万人死亡。青蒿素等药物在治疗疟疾时已经表现出了很大的效果，但是，在根除这种疾病时，疟原虫对这些抗疟疾药物的抗药性是必须要克服的难题之一。一个可供选择的可能更为有效的方法是利用疫苗在早期就阻止其传染。但是已有的疫苗候选物表现出较低的效力和较短的时效性，且只对部分疟原虫株有效。目前仍没有疫苗能够有效的填补这些疫苗的缺陷。
　　MSP2是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）裂殖予表面第二丰富的蛋白，已有研究显示MSP2可能参与疟原虫粘附和入侵宿主红细胞，因此是潜在的抗疟疾疫苗候选物或药物靶标。已开发的MSP2疫苗——有些已达到临床二期试验阶段——显示其对阻遏部分疟原虫入侵红细胞有显著效果。像其它的疟疾疫苗候选物一样，这些MSP2疫苗候选物只对部分疟原虫株有效，而基于蛋白质多态性的复合MSP2疫苗相对更有效。为提升MSP2作为抗疟疾疫苗的潜能，有必要对其性质和功能的分子机制进行深入探究。
　　MSP2是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，包括保守的N端和C端以及多变的中间可变区。根据中间可变区将MSP2分成两大家族: FC27-MSP2和3D7-MSP2。MSP2的功能目前还并不清楚。前期的研究表明MSP2大部分区段是无序的，但N端区段呈现出更高的螺旋结构的倾向性且可与膜相互作用。当与膜结合时，MSP2的N端区段被诱导形成更多的螺旋结构。另外，MSP2在体外易于形成淀粉样纤维，并且在裂殖子表面也呈现聚集状态。据此推断MSP2可能像其它淀粉样纤维蛋白Aβ和α-synuclein一样，以聚集体形式与膜相互作用，在膜上形成孔道或者通过其它机制来破坏膜，从而参与入侵宿主细胞。在MSP2的聚集中，N端保守区也是聚集区域，它构成了聚集体的核心。总之，相对有序的N端保守区是MSP2的关键区段。那么，相对无序的其它区段特别是可变的中间区在MSP2中扮演什么角色？解答这个问题有助于我们更好地理解MSP2的功能机制并据此开发更高效的疫苗。
　　在本研究中，我们利用浊度、透射电镜、核磁共振、圆二色谱以及荧光泄露等实验检测不同长度的3D7-MSP2片段——N段保守的25肽、包含中间可变区的N端肽段及3D7-MSP2全长蛋白——的聚集和与膜的相互作用，以揭示无序区段对有序区段性质的影响。其中浊度和透射电镜用于监测小肽和蛋白的聚集（包括聚集动力学和聚集体形态）;圆二色谱和核磁共振用于检测小肽和蛋白的结构（整体结构和原子分辨结构）;而荧光泄露实验则用于监测膜的完整性。结果显示:1，随着所含无序区段长度的增加，3D7-MSP2的聚集逐次受到抑制;2，随着所含无序区段长度的增加，3D7-MSP2与膜的相互作用也逐次受到抑制。另外，还有一些现象值得注意:1，3D7-MSP2与膜的相互作用依赖于膜的形态，胶束可诱导MSP2形成螺旋结构并抑制其聚集，而脂质体则不诱导螺旋结构而且对聚集的作用是特异性的;2，3D7-MSP2与膜的相互作用依赖于膜的组成，PG促进聚集而PC抑制聚集;3，MSP2对膜结构有破坏作用，很可能是通过其寡聚体形式。根据以上结果，我们对MSP2在疟原虫表面的状态及其参与入侵宿主细胞的作用机制做出了推断。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 疟疾

1．2 恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2(MSP2)

1．3 侧翼无序区段对有序区段的影响

1．4 淀粉样纤维形成蛋白与膜相互作用的机制

1．5 生物膜与模拟膜

1．6 研究目的和意义

1．7 研究内容和技术路线

第二章 材料与方法

2．1 实验仪器与试剂

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 质粒与菌株

2．1．3 培养基与各种缓冲溶液的配制

2．2 不同长度的3D7-MSP2的获得

2．3 全长3D7-MSP2重组质粒的构建，表达和纯化

2．3．1 全长3D7-MSP2重组质粒的构建

2．3．2 3D7-MSP2-pET32a重组质粒的转化

2．3．3 重组3D7-MSP2蛋白的表达和纯化

2．4 模拟膜脂质体(SUV)的制备

2．5 纳米盘(Nanodisc)的制备

2．6 蛋白单体及其聚集体制备

2．7 蛋白聚集动力学的监测

2．8 淀粉样纤维聚集体形态检测

2．9 淀粉样纤维聚集体的二级结构的检测

2．1 0 小肽或蛋白对膜结构影响的检测

2．1 1 不同长度MSP2的构象的检测

第三章 结果与讨论

3．1 全长3D7-MSP2重组质粒的构建，表达和纯化

3．1．1 全长3D7-MSP2重组质粒的构建

3．1．2 融合蛋白的表达和纯化

3．2 SUV和Nanodisc的组装和纯化

3．3 SUV和Nanodisc的透射电镜表征

3．4 中间可变区和C端区段对3D7-MSP2聚集的影响

3．4．1 不同长度3D7-MSP2片段的聚集动力学

3．4．2 不同长度3D7-MSP2片段的聚集体形态

3．5 中间可变区和C端区段对3D7-MSP2与膜相互作用的影响

3．5．1 不同长度3D7-MSP2片段在不同膜环境下的聚集

3．5．2 不同长度3D7-MSP2片段对膜的作用

3．6 MSP2中间可变区和C端区段对N端区段构象的影响

讨论

第四章 结论与展望

参考文献

附录

致谢