大豆蛋白纳米粒子的制备、表征及药物传递性能研究

摘要

近年来，癌症的发病率一直居高不下，尤其恶性肿瘤严重危害人们的身心健康。然而，针对癌症的治疗一直没能取得突破性的研究。新兴的细胞疗法、免疫疗法又或者基因治疗虽然取得一定成效，但目前的临床治疗手段仍以手术、放疗以及用各种各样的抗肿瘤药物化疗为主。其中，手术和放疗在临床上的适用性存在一定局限性，而药物化疗的治疗方式具有多元化、适用范围较广的特点。然而，单纯的药物化疗也存在一些缺陷，如利用效率较低、对机体正常组织也会造成一定的损伤。与传统的小分子化疗药物相比，纳米药物传递系统能显著延长药物半衰期、靶向性在肿瘤部位富集、降低患者痛苦以及经济负担。因此，近几十年来针对纳米药物载体的研究在全世界范围内兴起。
　　合格的纳米药物载体应当在生理环境下具有良好的稳定性、对机体无毒副作用并且在体内易被清除，同时对药物具有高负载以及可控释放的能力。通过调节载体的组成、尺寸、形貌、表面电荷等，可以制备多种具有不同结构的纳米药物载体，如脂质体、胶束、聚合物纳米粒、纳米凝胶等，从而实现药物的有效负载。同时，针对肿瘤部位异常的生理环境如弱酸性、较高的温度、较高的GSH浓度等而开发的一系列具有刺激响应性的纳米药物载体在一定程度上能够达到较好的药物控释作用。此外，大部分纳米药物输送体系需要进入细胞内部才能最终实现治疗效果，而一系列功能化（叶酸、转铁蛋白、半乳糖）修饰的载体能更好的促进纳米载体的细胞摄取，提高药物在胞内的富集。
　　本论文以天然产物大豆分离蛋白为原材料设计了一种尺寸均一、结构稳定的纳米粒子作为药物载体，并在其表面修饰肿瘤靶向小分子配体叶酸，以达到肿瘤靶向富集和pH依赖释放药物的目的，具体工作如下:
　　(1)以酶法改性为主，探究出最优条件降解大豆分离蛋白，再通过离心、透析等纯化方法获得具有良好水溶性的低分子量的大豆蛋白(SP)。通过正交试验获得了大豆分离蛋白的酶法改性的最佳条件。最佳反应条件为:0.9％、酶浓度、酶解时间11h，加热预处理15min，底物浓度7％。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳显示大豆蛋白分子量约为15～17KDa，分布相对集中。
　　(2)以水溶性大豆蛋白为亲水性的大分子材料，3-丙烯酰氨基苯硼酸为疏水性单体，通过自由基共聚的方法制备得到大豆蛋白纳米粒子(SPNPs)。将叶酸(FA)修饰到大豆蛋白侧链，用同样的方法制备得到靶向大豆蛋白纳米粒子(FA-SPNPs)。马尔文纳米粒度仪(DLS)检测显示两种纳米粒子均有很好的分散性，粒径约在200nm，且在生理环境下具有良好的稳定性。透射电镜和扫描电镜显示两种粒子形貌规整，整体呈球形，分布均一。将抗肿瘤药物阿霉素(DOX)负载到纳米粒子上，得到的载药纳米粒子体外药物释放具有pH依赖性。
　　(3)利用平面及三维细胞模型详细研究了两种载药纳米粒子的细胞摄取及抗肿瘤活性。激光共聚焦显微镜及流式细胞仪观察结果证明两种载药纳米粒子均能被平面细胞摄取，而叶酸修饰的纳米粒子能更有效地进入细胞;MTT细胞毒性实验表明空白纳米载体无毒性，有较好的生物相容性;载药纳米粒子杀伤细胞呈剂量依赖性;三维细胞模型实验发现叶酸修饰的靶向载药纳米粒子能更有效地渗透到多细胞球体内部从而抑制球体生长;构建小鼠皮下异种移植瘤模型，并进行药物分布、抗肿瘤评估、组织学研究;结果表明，载药纳米粒子在体内有更长久的循环并在肿瘤部位有更高的富集，靶向纳米粒子有更显著的抑瘤效果，抑制率达到70.39％;组织切片表明载药纳米粒子能降低阿霉素的心脏毒性并且对机体主要组织器官没有显现损伤。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 纳米药物传递系统

1．2 肿瘤组织的特异性

1．3 pH敏感的纳米载体给药机制

1．3．1 基于质子化／去质子化纳米载体

1．3．2 基于酸敏感化学键纳米载体

1．4 靶向纳米药物载体

1．5 大豆分离蛋白在药物载体领域的应用

1．6 选题思路及研究内容

第二章 大豆分离蛋白的改性与优化

2．1 引言

2．2 实验试剂和仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 大豆分离蛋白的酶解

2．3．2 大豆蛋白的纯化

2．3．3 SDS-PAGE分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 加热预处理时间对蛋白水解的影响

2．4．2 底物浓度对蛋白水解的影响

2．4．3 酶浓度对蛋白水解的影响

2．4．4 酶解时间对蛋白水解的影响

2．4．5 酶解条件的优化

2．4．6 大豆蛋白的纯化及分子量分析

2．5 本章小结

第三章 大豆蛋白纳米粒子的制备及理化性质检测

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 叶酸修饰大豆蛋白

3．3．2 纳米粒子的制备

3．3．3 纳米粒子稳定性与电位检测

3．3．4 纳米粒子形貌观察

3．3．5 纳米粒子元素分析

3．3．6 纳米粒子载药及体外释放

3．4 结集与讨论

3．4．1 叶酸修饰大豆蛋白

3．4．2 纳米粒子的制备

3．4．3 稳定性与电荷分析

3．4．4 载药及体外释放

3．5 本章小结

第四章 生物学效应评估

4．1 引言

4．2 实验试剂和仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 试剂的配制

4．3．2 平面细胞毒性实验

4．3．2 细胞摄取纳米粒子的定性与定量分析

4．3．3 多细胞球体的渗透和抑制

4．3．4 体内生物学效应评估

4．4 结果与讨论

4．4．1 平面细胞毒性实验

4．4．2 平面细胞摄取定性分析

4．4．3 平面细胞摄取定量分析

4．4．4 多细胞球体渗透

4．4．5 多细胞球体的生长抑制

4．4．6 体内药物分布

4．4．7 体内抗肿瘤

4．4．8 组织学分析

4．5 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文