去PEG化介导的增强细胞摄取和抗肿瘤效果的pH超敏感胶束的制备以及性能研究

摘要

药物传递系统(DDS)因在抗肿瘤领域能有效降低和改善小分子药物的毒副作用而被广泛研究，如纳米粒子、纳米凝胶等。这些纳米药物载体具有高载药量，以及优秀的血液循环稳定性等，并且能有效的在肿瘤组织富集，以及对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。基于肿瘤组织及胞内环境，越来越多的刺激响应性纳米载体被设计制备出来，比如还原刺激响应性纳米载体和pH刺激响应性纳米载体更是药物传递领域研究的热点。而刺激响应性PEG化纳米粒子能在血液循环中稳定，避免被网状内皮系统(RES)清除，在血液中“隐形”，但刺激响应性PEG化纳米粒子存在降低细胞摄取等缺陷。因此有必要设计一种PEG化纳米粒子在血液循环保持稳定的同时又能增强肿瘤细胞摄取，提高抗肿瘤效果。
　　在本文中，主要工作是设计制备一种通过去PEG化增强细胞摄取的pH超敏感胶束。以聚氨酯(PUAL-g-NH2)为疏水主链，在侧链接枝亲水性原酸酯(OEMPEG)，制备了侧链接枝原酸酯的两亲性共聚物PUAL-g-OEMPEG，然后对共聚物的结构和胶束性能进行表征。本文主要工作包含以下内容:
　　(1)以丝氨醇和六亚甲基二异氰酸酯为起始反应物，在较温和的条件下通过缩聚反应得到共聚物PUAL-g-NH2，然后再以一端氨基原酸酯通过酯交换制备了含亲水基团的原酸酯OEMPEG，最后在共聚物PUAL-g-NH2的活性基团接枝不同比例的OEMPEG，得到PUAL-g-OEMPEG共聚物。核磁氢谱(1HNMR)对PUAL-g-OEMPEG进行结构表征，PUAL-g-OEMPEG的分子量使用凝胶渗透色谱(GPC)进行测定。结果显示聚合物PUAL-g-OEMPEG的结构正确，并且聚合物PUAL-g-OEMPEG的分子量(Mn)分别3.91×104，3.25×104和2.74×104，且分布均匀。
　　(2)通过透析法将共聚物PUAL-g-OEMPEG制备成胶束，并测定胶束的临界胶束浓度(CMC)，结果分别9×10-4mg/mL，5×10-4mg/mL和0.8×10-4mg/mL，表明胶束有较高的稳定性。动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)结果表明胶束的粒径分布在150-240nm，形貌为规整球形。粒径降解和核磁跟踪检测了原酸酯侧链水解、降解速率以及粒径变化，结果表明PUAL-g-OEMPEG在生理条件(pH=7.4)稳定，在模拟肿瘤胞外微酸环境即pH=6.5时，侧链在24小时完全水解，实现快速去PEG化，在pH=5.0时，在12时侧链完全水解。另外在pH=6.5，由于去PEG化导致粒径有先减少后增大的发生动态变化趋势，说明原酸酯侧链水解速率具有pH依赖性及时间依赖性，以及在pH=6.5时可以实现快速去PEG化，并由于去PEG化，导致胶束粒径的变化。
　　(3)将PUAL-g-OEMPEG胶束对阿霉素(DOX)进行包载，制备得到载药胶束粒子。体外药物释放表明，在pH=5.0时，三种载药胶束的释药速率由于亲水性的不同而有所差异，但都有较快的释药速率。细胞毒性(MTT)实验评价胶束PUAL-g-OEMPEG和PUAL-g-OEMPEG-DOX胶束在不同pH下的细胞毒性，结果显示PUAL-g-OEMPEG胶束没有毒性，PUAL-g-OEMPEG-DOX胶束可有效杀死细胞，并且会呈现浓度的依赖性。另外相比于正常条件，在在模拟肿瘤胞外微酸环境即pH=6.5的时PUAL-g-OEMPEG-DOX胶束由于去PEG化有更强的细胞毒性。激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪检测细胞摄取情况。结果表明，在pH=6.5时可以实现快速去PEG化并增强HepG2和SH-SY5Y两种细胞的细胞摄取。构建3-D多细胞球体评价PUAL-g-OEMPEG-DOX胶束的抗肿瘤效果。结果表明，载药胶束粒子有较强的渗透能力并且呈现时间依赖性，而且三种载药胶束由于不同的接枝率导致在渗透效率上存在差异，但都优于裸药，并且载药胶束粒子可以有效抑制多细胞球的生长。
　　综上所述，这种基于去PEG化和粒径动态变化的pH超敏感胶束能有效提高细胞摄取能力，在药物传递和抗肿瘤领域具有巨大潜力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 纳米药物传递系统

1．3 刺激响应性聚合物胶束

1．3．1 聚合物胶束

1．3．2 刺激响应性聚合物胶束

1．4 刺激响应性PEG化／去PEG化纳米载体

1．4．1 刺激响应性PEG化纳米载体

1．4．2 刺激响应去PEG化纳米药物载体

1．5 胞外pH超敏感纳米药物载体

1．5．1 胞外pH超敏感纳米药物载体

1．5．2 胞外pH超敏感纳米胶束

1．6 本文设计思路及研究内容

第二章 接枝共聚物PUAL-g-OEMPEG的合成及表征

2．1 引言

2．2 实验试剂和仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 4-氨基甲基-2－(-甲氧基)聚乙二醇基-1，3-二氧戊环

2．3．2 侧链接枝氨基主链聚氨酯PUAL-g-NH2的合成

2．3．3 侧链接枝OEMPEG主链聚氨酯PUAL-g-OEMPEG的合成

2．4 表征方法

2．4．1 核磁共振(NMR)检测结构

2．4．2 凝胶渗透色谱仪(GPC)测量分子量

2．5 结果与讨论

2．5．2 侧链接枝氨基主链聚氨酯PUAL-g-F3的核磁分析

2．5．3 侧链接枝氨基主链聚氨酯PUAL-g-NH2的核磁分析

2．5．4 侧链接枝OEMPEG主链聚氨酯PUAL-g-OEMPEG的核磁分析

2．5．5 接枝共聚物的GPC分析

2．6 本章小结

第三章 接枝共聚物PUAL-g-OEMPEG胶束的制备及超pH敏感性能研究

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3．1 接枝共聚物PUAL-g-OEMPEG胶束的制备

3．3．4 PUAL-g-OEMPEG胶束的形貌表征

3．3．5 胶束侧链pH依赖的降解及降解速率的测定

3．3．6 胶束基于pH超敏感的粒径变化的测定

3．4 结果与讨论

3．4．2 PUAL-g-OEMPEG胶束的粒径及形貌

3．4．3 胶束侧链pH依赖的降解及降解速率的测定

3．4．4 胶束基于pH超敏感的粒径变化

3．5 本章小结

第四章 载阿霉素胶束的制备及体外性能研究

4．1 引言

4．2 实验试剂和仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．1 实验试剂

4．3 实验方法

4．3．1 载阿霉素胶束粒子的制备

4．3．2 测定载药胶束的载药量(DLC)和包埋率(DLE)

4．3．3 载药胶束基于pH敏感的体外药物释放

4．3．4 空白胶束以及载阿霉素胶束的细胞毒性的测定

4．3．5 细胞对载药胶束粒子摄取的测定

4．3．6 载药胶束粒子对SH-SY5Y多细胞肿瘤球的渗透

4．3．7 载药胶束粒子对SH-SYSY多细胞肿瘤球的生长抑制

4．4 结果与讨论

4．4．1 载阿霉素胶束粒子的制备

4．4．2 载药胶束基于pH敏感的体外药物释放

4．4．3 空白胶束粒子以及不同pH下载药胶束粒子的细胞毒性

4．4．4 细胞对载药胶束粒子摄取的测定

4．4．5 载药胶束粒子对SH-SY5Y多细胞肿瘤球的渗透

4．4．6 载药胶束粒子对SH-SY5Y多细胞肿瘤球的生长抑制

4．5 本章小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间学术成果