逐步pH靶向性口服纳米药物载体的制备及体内外表征

摘要

化疗药物已经广泛用于癌症临床治疗，实验表明它能有效地抑制癌细胞生长和诱导细胞凋亡，但其较差的溶解性和吸收率以及复杂的生理屏障会严重影响药物对体内肿瘤的治疗效果。此外，临床上药物进入机体主要通过口服或者静脉的方式，这两种方式均存在对应的缺陷。因此需要利用药物载体包载药物后再送入机体，保证在特定条件下释放药物，以避免药物所产生的系统毒性。研究人员针对口服给药和静脉给药设计了一系列的药物载体，例如胃肠道靶向吸收的口服药物载体，纳米药物传递载体(Nano-DDS)，它们能够起到较好的效果。并且这两种给药方式都有相应的优点，例如口服给药方便简单，生物安全性高;静脉给药能达到最高的绝对生物利用度（Absolute bioavailability,AB），药物发挥作用更快。但仅针对口服或静脉给药单方面进行改良的药物载体，都有一些无法避免的缺点:口服给药会造成极强的首过效应，最终导致更低的AB和更高的药物毒性;静脉注射的给药方式会破坏皮肤且给药后药物浓度瞬间变化，可能引起较大的给药风险，对应的给药生物安全性低。此外，由于口服给药体系和静脉注射体系存在明显的pH梯度。因此可以通过设计一种具逐步pH靶向性的药物载体来整合静脉注射和口服给药的优点以尽可能改善二者的缺点。
　　本文拟制备一种具有双层结构的口服纳米药物载体，外层为羧甲基壳聚糖(CMC)涂层，它能在胃部强酸环境中保护内部载药核心不被降解，最大程度上避免药物伤害胃肠道;并且在肠道内CMC涂层靶向小肠上皮细胞并打开紧密连接（Tight junctions，TJs）来促进吸收。内部为疏水核心包括聚（原酸酯-氨酯）P(OE-HMDI-CL)和化疗药物，它能保证该药物载体被吸收进入血液后长时间稳定循环，随后通过实体瘤的高通透性和滞留(EPR)效应的被动靶向达到高效富集。最终癌细胞的微酸环境触发原酸酯键断裂，药物载体崩解使得药物在癌症细胞内快速富集，拟实现在高效地杀灭癌症细胞的同时降低系统毒性。
　　本实验通过在温和条件下分步聚合的方式，将酸敏感性的二羟基原酸酯单体(OEOH)和高疏水性的聚己内酯(PCL)等比例地引入聚（原酸酯-氨酯）。核磁氢谱(NMR)和凝胶渗透色谱(GPC)表征结果表明该聚合物被成功合成并且分子量(Mn=1.81×104)适中。接着通过常用的水包油超声乳化法制备不同的纳米微球:分别用聚乙烯醇(PVA)或CMC来制备单层纳米微球（对照组）或双层纳米微球，对应命名为NP1和NP2。通过透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)观察到NP1和NP2的微观形貌，成功证明NP2为双层结构。动态光衍射(DLS)检测表明NP1和NP2的水合粒径分别为196.3nm和359.8nm。通过傅立叶红外光谱仪(FT-IR)和NMR表征，以及观察NP1和NP2的离子缓冲能力，发现NP2为NP1和CMC的混合物，并且CMC位于NP2的外部。
　　然后通过模拟不同生理环境的体外和体内实验来验证纳米微球的稳定性。首先，将NP1和NP2分别与体外强酸环境(pH=1.0)和胃部模拟液孵育一段时间后，发现了完全不同的状况。NP1悬浮液由于原酸酯键快速断裂，纳米微球崩解导致溶液很快就出现沉淀，而NP2悬浮液却能稳定存在，有极强的耐受强酸性。随后，在体内验证NP2的稳定性，发现高剂量的NP2通过口服的方式送入小鼠体内后，能在小鼠血清中观察到稳定的纳米微球结构，表明NP2能以药物载体的形式穿过小肠间隙，并且无明显的降解现象。
　　作为理想化的口服药物载体，极好的生物相容性和生物安全性是必不可少的。MTT实验表明NP1和NP2均不会对NIH/3T3细胞的生长造成任何抑制效果，各种不同浓度的纳米微球与细胞孵育后存活率均能到达95％以上。对小鼠口服不同剂量纳米微球的急性毒性实验发现即使在超高剂量的NP1或NP2(2000mg/kg)灌胃后，小鼠均正常增长。即使在摄入纳米微球14天后，小鼠的血浆生化指标也均无异常且对小鼠主要器官也无显著毒性。
　　本实验旨在尽可能改善游离阿霉素(Free DOX)所产生的严重心脏毒性，因此将DOX制备成一种口服纳米药物载体，分别命名为NP1/DOX和NP2/DOX。通过计算发现，NP1/DOX和NP2/DOX的载药率(DLC)分别为14.32％和17.27％，表明NP1和NP2均能高效地负载药物。在体外模拟体内环境进行药物释放研究，结果表明载药纳米微球均能在低pH(5.0)条件下稳定地进行药物释放;而在强酸条件(pH=1.0)下，仅有NP2/DOX能长时间保持药物不被释放。
　　相对较高的口服AB和合理的药物分布是作为口服药物载体的重中之重，本实验就free DOX、NP1/DOX和NP2/DOX的口服AB进行研究，同时设定静脉注射剂量为6mg/kg free DOX的AB为100％。结果表明小鼠灌胃10mg/kg剂量的NP2/DOX后所达到的AB是75.4％，这分别是free DOX和NP1/DOX在相同剂量条件下口服AB的3.83和2.77倍，表明该双层纳米药物载体能显著提高DOX的口服AB。同样对3种不同药物配方给药后的药物分布情况进行测定，研究发现在口服free DOX和NP1/DOX后心脏内DOX的富集量较高，其最大值均超过了4μg/g tissue，这将会带来极大的风险，但相反肿瘤组织内DOX的含量却很低。而NP2/DOX组却有不同的实验现象，在口服该药物剂型后心脏内DOX的浓度一直都未超过1.6μg/g tissue;且肿瘤组织内DOX的浓度相对于其他不同的剂型药是最高的，最大值接近于8μg/g tissue。这是由于NP2/DOX可以以药物载体的形式进入血液，然后通过EPR效应被动靶向肿瘤组织以达到高效富集。
　　最后，通过体内实体瘤的抑制效果和治疗过程中对器官的损伤情况对该药物载体的实际体内性能进行评估。本实验首先建立肝癌(H22)小鼠模型，然后采用剂量为10mg/kg的free DOX，NP1/DOX，NP2/DOX进行连续口服治疗，此期间选取生理盐水(Saline)，NP1和NP2作为阴性对照组。研究发现各个阴性对照组即使在连续灌胃7天后均无明显区别，进一步验证了纳米微球具备优异的生理相容性。虽然free DOX和NP1/DOX组相比于阴性对照组对肿瘤组织有一定的生长抑制效果，但并不是很明显;此外心脏和胃肠道切片显示这些DOX剂型会产生极强的系统毒性。而NP2/DOX治疗组出现了与其他治疗组不同的治疗效果，随着治疗天数的延长，肿瘤体积和重量均明显减小。在经过NP2/DOX连续治疗7天后，肿瘤的重量仅仅为0.28g，这分别仅为saline，free DOX和NP1/DOX治疗7天后肿瘤重量的14.99％，19.60％和19.95％，对应的肿瘤切片也显示该组肿瘤组织内细胞损伤区域面积最大并且程度最为明显。最为重要的是经过连续7天的NP2/DOX治疗后，小鼠的胃部和肠道切片显示没有明显的损伤，进一步验证了NP2在胃肠道中的超高稳定性;同样地，对应NP2/DOX治疗后的心脏切片与对照组的形貌区别不大，表明该双层纳米药物载体不会产生心脏毒性，具有超高的生物安全性。
　　综上所述，该双层结构的纳米药物载体(NP2/DOX)能通过口服的方式，达到非常高的生物利用度(75.4％)，连续给药后无系统毒性并且能达到很好的抗癌效果。因此NP2/DOX在口服给药领域具有很好的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 癌症治疗的现状

1．2 口服给药体系

1．2．1 口服给药生理屏障

1．2．2 胃部靶向恒速释放药物

1．2．3 肠道靶向释放药物

1．2．4 理想化药物剂型

1．3 静脉注射药物剂型

1．3．1 主动靶向和被动靶向

1．3．2 癌症细胞微环境

1．3．3 pH敏感性化学键

1．3．4 原酸酯基NANO-DDS

1．4 主要研究内容及拟解决的问题

1．4．1 选题依据

1．4．2 拟达到的药物吸收过程

1．4．3 研究内容

第二章 pH敏感及高疏水性三嵌段共聚物的合成及表征

2．1 引言

2．2 实验试剂和仪器

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 实验试剂预处理

2．3．2 酸敏感二端羟基原酸酯(OEOH)的合成

2．3．3 聚(原酸酯-氨酯)的制备

2．3．4 纳米微球的制备

2．4 合成产物相关表征实验

2．4．1 OEOH结构表征

2．4．3 纳米微球结构表征

2．5 结果与讨论

2．5．1 OEOM的结构分析

2．5．2 P(OE-HMDI-CL)结构表征

2．5．3 纳米微球结构表征

2．6 本章小结

第三章 口服型纳米药物载体的稳定性和载药释药性能研究

3．1 引言

3．2 实验试剂和仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 体外稳定性研究

3．3．2 体内稳定性研究

3．3．3 载药纳米微球的制备及载药性能检验

3．3．4 药物释放动力学研究

3．4 结果与讨论

3．4．1 稳定性分析

3．4．2 载药性能分析

3．4．3 NPs/DOX的药物释放动力学研究

3．4 本章小结

第四章 药物载体的体外和体内毒性评价

4．1 引言

4．2 实验试剂和仪器

4．2．1 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养

4．3．2 体外细胞毒性实验

4．3．3 急性毒性实验

4．4 结果分析

4．4．1 细胞毒性分析

4．4．2 急性毒性实验结果分析

4．5 本章小结

第五章 药代动力学和药效学评价及药物副作用分析

5．1 引言

5．2 实验试剂和仪器

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 小鼠肝癌模型的建立

5．3．2 生物利用度分析

5．3．3 药代动力学分析

5．3．4 体内抗肿瘤实验

5．3．5 组织切片分析

5．4 结果与讨论

5．4．1 生物利用度

5．4．2 组织药物浓度分析

5．4．3 肿瘤抑制效果分析

5．4．4 药物毒性分析

5．5 本章小结

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间学术成果