抗菌肽Uperin3.5和Uperin3.6的聚集及其与膜相互作用机制的初步研究

摘要

抗菌肽因其具有广谱抗菌活性，已成为科研工作者研究的热点。抗菌肽的阳离子性和两亲性可介导其与细菌细胞表面阴离子组分的相互作用，破坏细胞膜导致细胞死亡。近年来，关于抗菌肽与膜的作用机制已逐步展开，但是其作用机理仍然没有一个权威的解释。
　　Uperin3.5和Uperin3.6是源于澳大利亚小蟾Toadlet Uperoleia mjobergii的皮肤分泌物，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌，表现出抗菌活性，具有潜在的应用前景。Uperin3.5和Uperin3.6大部分序列相同，但表现出了显著不同的聚集倾向性。Uperin3.5和Uperin3.6的抗菌机制目前尚不明确。本文主要探讨了Uperin3.5和Uperin3.6的聚集差异及影响差异的关键位点，同时研究了其与不同的模拟膜的相互作用，旨在阐明Uprin3.5和Uperin3.6聚集与结构的关系及其抑菌机制。
　　本文首先运用预测淀粉样纤维形成倾向性的软件分析Uperin3.5聚集的关键位点，在潜在的关键位点对Uperin3.5和Uperin3.6进行交换突变。运用硫黄素T结合荧光、圆二色谱等对突变体小肽的聚集和结构进行了检测。结果显示两种抗菌肽聚集的关键位点是位于C端的最后两个疏水氨基酸，由其疏水性量的差异所决定。这一成果可为阐明淀粉样纤维的聚集机制做出贡献。
　　其次利用硫黄素T结合荧光、圆二色谱、荧光泄露等方法检测了Uperin3.5和Uperin3.6与不同组分的膜之间的相互作用。结果显示Uperin3.5和Uperin3.6与膜的相互作用依赖于膜的形式和组分，该相互作用对抗菌肽的聚集和膜的完整性都有影响。这些成果可为Uperin3.5和Uperin3.6抗菌机制的阐明做出贡献。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 抗菌肽

1．1．1 天然抗菌肽的分布

1．1．2 抗菌肽的生理学功能

1．1．3 抗菌肽的作用机理

1．1．4 抗菌肽的应用及展望

1．2 Uperin抗菌肽

1．2．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6聚集和与膜的相互作用

1．2．3 模拟膜

1．3 研究目的和意义

1．4 研究内容和技术路线

第二章 Uperin 3．5和Uperin 3．6的异源表达

2．1 材料和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 培养基与各种溶液的配制

2．1．4 聚丙烯酰胺凝胶的配制

2．1．5 琼脂糖凝胶的配制

2．2 方法

2．2．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6重组表达质粒的构建

2．2．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6重组表达质粒转化和菌株筛选

2．2．3 重组Uperin 3．5和Uperin 3．6的表达和纯化

2．3 结果

2．3．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6重组表达质粒的构建

2．3．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6重组表达质粒转化和菌株筛选

2．3．3 重组Uperin 3．5和Uperin 3．6的表达和纯化

2．4 讨论

第三章 Uperin 3．5和Uperin 3．6的聚集

3．1 材料和仪器

3．1．1 实验仪器

3．1．2 溶液的配制

3．1．3 小肽

3．2 方法

3．2．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6的聚集动力学测定

3．2．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6聚集体的形态检测

3．2．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6的结构检测

3．2．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6的聚集倾向性分析

3．3 结果

3．3．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6的聚集动力学

3．3．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6聚集体的形态

3．3．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6的结构

3．3．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6的聚集倾向性

3．4 讨论

第四章 Uperin 3．5和Uperin 3．6交换突变体的聚集

4．1．材料和仪器

4．1．1 实验仪器

4．1．2 溶液的配制

4．1．3 小肽

4．2 方法

4．2．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集倾向性的分析

4．2．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集动力学测定

4．2．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集体形态检测

4．2．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的结构检测

4．3 结果

4．3．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集倾向性

4．3．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集动力学

4．3．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的聚集体形态

4．3．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6突变体的结构

4．4 讨论

第五章 Uperin 3．5和Uperin 3．6与膜的相互作用

5．1 材料

5．1．1 实验仪器

5．1．2 质粒与菌株

5．1．3 小肽

5．1．4 培养基与各种溶液的配制

5．1．5 SUV模拟膜的制备

5．2．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6在模拟膜环境下的结构检测

5．2．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6对模拟膜完整性影响的检测

5．3 结果

5．3．1 Uperin 3．5和Uperin 3．6在模拟膜环境下的聚集动力学

5．3．2 Uperin 3．5和Uperin 3．6在模拟膜环境下的聚集体形态

5．3．3 Uperin 3．5和Uperin 3．6在模拟膜环境下的结构

5．3．4 Uperin 3．5和Uperin 3．6对模拟膜完整性的影响

5．4 讨论

第六章 结论与展望

参考文献

致谢