pH敏感的小分子前药协同输送体系的构建及体内外抗肿瘤活性研究

摘要

化疗是临床上治疗恶性肿瘤主要的治疗策略，然而许多一线抗癌药物如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿霉素(DOX)等由于肿瘤选择性较差，导致治疗效果不显著并且伴随着严重的毒副作用。近年来，随着纳米药物输送体系的不断发展和深入研究，具有良好生物相容性的小分子纳米前药输送体系成为肿瘤治疗的研究热点。小分子前药不仅保留了传统物理包埋纳米药物载体及高分子前药的优点，而且具有结构明确、制备简单、载药量高、代谢清楚等优势，从而实现药物的精确调控，增强化疗效果。然而，目前小分子纳米前药输送体系依然没有在临床上得到应用，究其原因是肿瘤内部存在生理屏障，仅仅通过肿瘤的渗透和滞留(EPR)效应无法在肿瘤部位取得理想的药物浓度，以及被肿瘤细胞摄取后小分子前药无法短时间内快速释放药物，影响杀死肿瘤细胞能力。鉴于此，迫切需要开发一种新型的小分子前药纳米输送体系，结合协同给药的优势，显著提高药物在肿瘤部位的靶向富集、细胞摄取以及胞内可控释放药物的能力。 由于肿瘤细胞异常的代谢，导致肿瘤组织微环境与正常组织存在差异。因此可利用肿瘤组织特异的微环境实现药物在肿瘤部位的靶向富集和可控输送。pH敏感的药物输送体系由于具有酸响应基团或化学键，可特异性地识别肿瘤微酸环境。所以，选择合适的酸响应基团或化学键，并且通过进一步的结构优化，有望构建理想的pH敏感的小分子前药输送体系。研究表明，在同等微酸条件下，原酸酯键的水解能力比乙缩醛，缩酮，腙键等快1-4个等级。因此，可选择原酸酯键构建兼具肿瘤靶向富集及可控、高效释药的pH敏感小分子前药。 本论文基于原酸酯键、5-氟尿嘧啶和硬脂醇构建了pH敏感的小分子前药输送体系，再通过包埋疏水性化疗药物阿霉素(DOX)制备pH敏感的小分子前药协同输送体系，最后通过一系列体内外抗肿瘤实验评估其化疗效果。具体研究内容如下: (1)硬脂醇与2，2，2-三氟-N-（2-甲氧基-[1，3]二戊烷-4-亚甲基）乙酰胺(OE)进行酯交换，产物与5-氟尿嘧啶-1-乙酸进行酰胺反应，制成具有pH敏感的的小分子前药(C18-oe-fu)，作为对照，硬脂醇与5-氟尿嘧啶-1-乙酸直接反应合成不含原酸酯键的5-氟尿嘧啶小分子前药(C18-5fu)，分别通过1HNMR、13CNMR和质谱证实两种前药小分子合成正确。 (2)利用水包油单层乳液挥发法将两种小分子前药分别制备成5-氟尿嘧啶纳米前药输送体系(NP1)和pH敏感的5-氟尿嘧啶纳米前药系输送体系(NP2)。通过透射电镜(TEM)和纳米粒度仪(DLS)测定两种前药纳米输送体系的粒径都在200nm以内，并且形貌规整、呈球形结构。原酸酯核磁共振和粒径降解实验显示NP2在中性环境原酸酯键无降解、粒径无变化，在pH5.0条件下原酸酯键降解、粒径逐步减小;而NP1在pH7.4和pH5.0时原酸酯键都未降解、粒径都无变化。通过NP1和NP2的体外降解行为对比，结果表明键合原酸酯键的NP2具有肿瘤胞内pH可降解特性。 (3)将另一种抗肿瘤药阿霉素包载在小分子前药纳米制剂的内部制备成双重载药纳米前药输送体系NP/DOX，测得其粒径约200nm，粒径相对较小，NP1/DOX和NP2/DOX药物载药量分别为20.7％和15.4％。体外药物释放实验表明，NP1/DOX中5-氟尿嘧啶和阿霉素在pH7.4和pH5.0条件下释放缓慢，120小时后释放20％左右，而NP2/DOX中5-氟尿嘧啶和阿霉素在pH7.4条件下释放缓慢，但在pH5.0条件下释放加速，120小时后释放80％左右。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪测定的结果显示，两种纳米前药输送体系协同输送体系均可被A549，HepG-2和H22细胞有效摄取A549，HepG-2和H22细胞在体外有效摄取，且NP2/DOX的摄取能力强于NP1/DOX，这可能是由于pH敏感的纳米前药输送体系协同输送体系被肿瘤细胞摄取后在胞内更易降解、释放药物的原因。体外细胞毒性实验表明，与三种癌细胞共培养24和48小时后，无论空白还是载阿霉素前药，pH敏感的小分子前药输送体系都表现出更强的杀死肿瘤细胞的能力，这与其胞内较快的酸响应性和药物释放能力密切相关。另外，细胞凋亡实验结果同样表明，pH敏感的纳米前药输送体系具有更有效的促进细胞凋亡的能力。 (4)小分子前药纳米输送体系在小鼠体内的药物分布实验结果表明，pH敏感的小分子前药输送体系可显著增强血液及肿瘤部位的药物浓度，且可降低药物在正常组织的分布。体内抑瘤实验结果表明，pH敏感的小分子前药纳米协同输送体系具有更强的抑瘤效果，且可显著延长负瘤小鼠的寿命。 综上所述，结构明确、制备方法简单的pH敏感小分子前药协同输送体系可显著降低毒副作用、增强抗肿瘤效果。通过进一步的功能修饰和结构优化，基于原酸酯键、5-氟尿嘧啶和阿霉素构建的pH灵敏小分子前药协同输送体系有望应用于临床研究。