白色念珠菌蛋白激酶Gin4的功能分析

摘要

白色念珠菌是一种常见的条件性致病真菌，是一类长期寄居在人类粘膜、皮肤、口腔、消化道、阴道等器官中的菌群。它可以以孢子体、菌丝体及假菌丝体三种形态存在。在免疫力正常的人体中，白色念珠菌可引起浅部感染，包括口腔炎、口角炎、皮肤念珠菌病、脚气病及阴道炎等。在艾滋病患者，癌症化疗患者等免疫力低下的人体内，白色念珠菌可导致深部感染，称为系统性感染，甚至危及生命。 在真菌中，Gin4蛋白是Nim1蛋白激酶家族的成员之一，是一个非常重要的细胞周期调控因子，Gin4能够调控细胞的胞质分裂、septin环组装、极性生长。虽然白色念珠菌Gin4是一个全长1349个氨基酸的蛋白，但是蛋白质序列比对只发现它的N端有一个260个氢基酸的蛋白激酶区段，其C端1000多个氨基酸都没有保守的功能区段，对C端的功能研究也比较缺乏。Hofi是白色念珠菌细胞分裂的重要调节因子，Bem1是白色念珠菌中重要的极性生长调控因子。Gin4、Hof1和Bem1蛋白对白色念珠菌细胞形态发生都发挥着重要作用。 本实验室前期通过免疫共沉淀实验发现Gin4分别与Hof1、Bem1蛋白在体内具有相互作用，为了进一步验证上述结果，本研究进行了融合蛋白体外结合实验，结果表明Gin4的C端区段Gin4-CT1(氨基酸1051-1349)可以结合到Hof1的C端区段(氨基酸300-599)，说明Gin4与Hof1蛋白在体外具有相互作用;Gin4的C端区段Gin4-CT1（氨基酸1051-1349）可以结合到Bem1的C端区段（氨基酸301-632），说明Gin4与Bem1蛋白在体外具有相互作用。为了进一步验证Gin4与Hof1在功能上是否相互影响，分别构建了Gin4关闭菌株、Gin4敲除菌株和Hof1敲除菌株，形态学观察发现，野生型细胞呈椭圆形的酵母态，Gin4敲除菌和Hof1敲除菌株细胞呈假菌丝生长，细胞不能正常分裂。形态学观察Gin4关闭菌株，细胞形态与敲除菌相似。在Gin4敲除菌中过表达Hof1蛋白，Gin4敲除菌的细胞形态与野生型细胞的形态相似，即呈椭圆形的酵母形态;在Gin4关闭菌株中过表达Hof1蛋白，几乎完全恢复了Gin4关闭菌的形态缺陷，呈椭圆形的酵母形态。同样地，在Hof1敲除菌中过表达Gin4蛋白时，Hof1敲除菌的生长形态与野生型菌株类似，呈椭圆形的酵母形态。这些结果充分证明Gin4与Hof1在不仅具有直接的相互作用，而且在功能上可以互补。为了进一步验证Gin4与Bem1在功能上是否相互影响，对Gm4-GFP在Bem1on菌株和Bem1shut off菌株中的分布进行了观察，结果表明在Bem1on菌株中Gin4-GFP分布在细胞的芽颈处，这一结果与前期报道一致。在Bem1shut off菌株中Gin4-GFP虽然在小部分细胞中仍然可以分布在芽颈处，但是在大多数细胞中无法观察到Gin4-GFP的荧光分布，说明Bem1直接影响Gin4的极性分布。 综合上述，本研究从以下几个方面对Gin4与Hof1之间的相互作用进行了验证。首先，通过免疫共沉淀和质谱分析实验发现Gin4和Hof1形成一个稳定的复合体（本实验室前期研究结果）;其次，通过融合蛋白体外结合实验，发现Gin4-CT1051-1349可以直接结合到Hof1-CT300-599;第三，在Gin4关闭菌或敲除菌中过表达Hof1蛋白，几乎可以完全恢复Gin4关闭菌或敲除菌的形态缺陷;最后，在Hof1敲除菌中过表达Gin4蛋白，也几乎可以完全恢复Hof1敲除菌的形态缺陷。这些结果充分证明Gin4和Hof1不仅具有直接的相互作用，而且在功能上可以互补。由于Hof1是白色念珠菌细胞分裂的重要调节因子，所以Gin4在白色念珠菌细胞分裂过程中也发挥着重要的调节作用。此外，本研究也通过融合蛋白体外结合实验和观察Gin4-GFP在Bem1关闭菌株中的荧光分布进一步验证了Gin4和Bem1之间的相互作用。Bem1是白色念珠菌中重要的极性生长调控因子，这些结果表明Gin4在白色念珠菌极性生长过程中也发挥着重要作用。