CDC50A阳性细胞在卵巢癌细胞系及原代细胞中干细胞特性的鉴定及相关研究

摘要

研究背景　　卵巢上皮癌(EOC)是致死率最高的妇科恶性肿瘤，其中75%的患者诊断时已为晚期(Ⅲ～Ⅳ)。在理想的肿瘤细胞减灭术的基础上辅助铂类药物为主的联合化疗后，约60～80%的患者发生肿瘤复发，晚期卵巢癌患者的中位生存时间仅为16～22个月，5年生存率约为30%[1]。肿瘤细胞对于化疗药物产生耐受性被认为是造成这一现象的主要原因之一。近期研究的靶向药物及小分子化合物的临床实验均未能显著改善卵巢癌患者的预后[2-4]。随着肿瘤基因组图谱的揭示，学者们对卵巢癌的研究主要致力于基因组及表观遗传学的变化对临床预后的影响。但是卵巢癌化疗耐药及肿瘤复发的机制仍不清楚，从而成为卵巢癌治疗中的最大障碍。　　干细胞是机体内一类具有自我更新能力和多向分化潜能的特殊细胞。根据其来源和分化能力，主要分为，胚胎干细胞、骨髓干细胞、以及成体干细胞。随着肿瘤生物学的发展，上世纪学者们提出了肿瘤干细胞(CSCs)理论。大量研究发现肿瘤中存在的极少量的CSCs，其既拥有类似干细胞自我更新及分化的特性，又维持着肿瘤细胞的致瘤性及细胞异质性，在肿瘤中长期处于静息状态，可以逃避化疗药的杀伤，导致肿瘤的耐药，疾病进展及复发[5-6]。早在1997年Bonnet等人[7]分离出表型为CD34+CD38-的白血病干细胞，首次在细胞水平上直观证实了肿瘤干细胞的存在。随后，CSCs理论在许多实体瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌等中得到验证，并建立了一系列CSCs分离、富集、鉴定及分子机制研究的方法。目前，CSCs的分离及富集方法主要包括：侧群细胞(side population，SP)的流式分选，根据特异性的CSCs表面标记蛋白的流式分选，以及肿瘤球形体(sphere)的培养等。　　近年来，许多致力于寻找卵巢癌治疗新途径的学者们也将目光转移到肿瘤干细胞，借鉴在其它实体瘤的研究中的成熟经验，探索了卵巢癌干细胞研究的新领域。目前对于卵巢癌干细胞的分选仍然是根据在其它实体瘤干细胞研究中的结果，采用表面标记蛋白的流式分选技术，使用最多的标记物主要包括，CD133、CD117、CD44、ALDHI、EPCAM、CD24、以及CD90等。虽然取得了一些研究进展，但由于这些标记物均来自于其它实体瘤干细胞的研究，其对卵巢癌干细胞的分离富集作用并不十分理想，仍然存在争论。因此，寻找卵巢癌特异性表面标记蛋白，成功分离并鉴定卵巢癌干细胞，对于未来卵巢癌的靶向治疗可能具有重大意义。　　本课题在前期工作中，采用稳定同位素标记和以质谱为基础的定量蛋白质组学技术对SP和非SP细胞的膜蛋白进行比较蛋白质组学分析，成功筛选出卵巢癌干细胞表面标记候选蛋白——跨膜蛋白30A（transmembrane protein 30A，简称TMEM30A或CDC50A），并在体外实验中对其表达阳性细胞的干细胞特性进行了初步鉴定。本研究采用流式细胞分选及无血清悬浮培养技术，通过体内和体外实验，在卵巢癌细胞系和卵巢癌患者的组织和腹水中验证CDC50A表面标记阳性(CDC50A+) EOC细胞的sphere形成能力，自我更新能力，分化能力及致瘤能力，检测其对顺铂的耐药性，并分析其表达与EOC患者临床预后的关系。并初步探讨雌激素在卵巢癌干细胞微环境中的作用及其对术后卵巢癌患者临床预后的影响。　　研究方法　　1、运用流式细胞学方法分析卵巢癌细胞系SKOV3，A2780，IGROV1，COC1，OVCAR3，ES2中CDC50A+细胞的比例。采用流式细胞仪分选CDC50A+及CDC50A-细胞，验证其在HG-DMEM/10%FBS培养基中体外培养后再次分化成其他亚群的能力。采用无血清悬浮培养的方法检测CDC50A+及CDC50A-细胞sphere形成能力及sphere传代能力，并运用免疫荧光及流式细胞学方法检测SKOV3 sphere对CDC50A的富集作用。流式分选出CDC50A+及CDC50A-细胞，分别等量梯度接种于NOD/SCID小鼠皮下，观察成瘤速度，观察终点为两组成瘤率或成瘤大小出现明显统计学差异。待小鼠成瘤后，再次分选出两群细胞接种小鼠，观察成瘤情况。流式分析移植瘤中CDC50A+细胞的比例，检测CDC50A+及CDC50A-细胞体内分化能力。　　2、收集EOC患者卵巢癌组织及腹水，分离卵巢癌细胞，运用流式细胞学方法分析原代卵巢癌细胞中CDC50A+细胞的比例。建立原代卵巢癌细胞sphere的培养方法，检测原代卵巢癌CDC50A+及CDC50A-细胞sphere形成能力及传代能力。运用免疫荧光及流式细胞学方法检测原代卵巢癌sphere对CDC50A的富集作用。流式分选出CDC50A+及CDC50A-细胞，分别等量梯度接种于NSG小鼠皮下，观察成瘤速度，观察终点为两组成瘤率或成瘤大小出现明显统计学差异。待小鼠成瘤后，再次分选出两群细胞接种小鼠，观察成瘤情况。流式分析移植瘤中CDC50A+细胞的比例，检测CDC50A+及CDC50A-细胞体内分化能力。　　3、MTT法验证SKOV3及ES2细胞系中CDC50A+及CDC50A-细胞对顺铂耐药性差异，流式细胞学方法检测不同浓度的顺铂对SKOV3/CDC50A+细胞的富集作用。流式细胞学方法检测顺铂化疗对EOC患者卵巢癌组织中CDC50A+细胞的富集作用；建立NOD/SCID小鼠卵巢癌移植瘤模型，检测顺铂化疗对小鼠移植瘤中CDC50A+细胞的富集作用。　　4、运用流式细胞学方法分析EOC患者卵巢癌原位灶及转移灶中CDC50A+细胞的比例，流式分析处于临床治疗不同阶段的EOC患者组织中CDC50A+细胞比例的分布情况，免疫组化分析76例EOC患者CDC50A蛋白的表达与临床预后的相关性。　　5、采用不同浓度的雌激素作用CDC50A+细胞，检测雌激素在维持卵巢癌干细胞的生长及自我更新中的作用。结合临床资料，回顾性分析术后激素替代治疗对卵巢癌患者的复发及生存的影响。　　研究结果　　1、流式检测发现6种卵巢癌细胞株中均存在少量CDC50A+细胞群，其比例稳定维持在0.4%～2%之间。流式分选出CDC50A+细胞亚群，在细胞分化条件下体外培养2周，再次流式分析发现CDC50A+细胞分化出CDC50A-细胞，其阳性率仍保持原来水平，而CDC50A-细胞未能分化出CDC50A+细胞，表明CDC50A+细胞具有分化潜能。无血清悬浮培养出SKOV3 sphere，流式分选出CDC50A+及CDC50A-细胞，分别悬浮培养，发现CDC50A+细胞形成sphere的个数明显多于CDC50A-细胞，CDC50A+细胞形成的sphere能连续体外传代至少4代，而CDC50A-细胞形成的sphere几乎不能传代。免疫荧光与流式分析均证实CDC50A+细胞在SKOV3sphere表达显著高于贴壁SKOV3细胞；体内动物实验进一步验证了CDC50A+细胞体内成瘤能力明显强于CDC50A-细胞，102个CDC50A+细胞即能使NOD/SCID小鼠成瘤，而至少104个CDC50A-细胞才能使NOD/SCID小鼠成瘤。CDC50A+细胞移植瘤能够在小鼠体内连续传代，而CDC50A-细胞移植瘤不能传代。HE染色显示CDC50A+细胞移植瘤与第二代移植瘤的组织学类型保持一致。流式分析显示CDC50A+细胞移植瘤中CDC50A阳性率保持不变，而CDC50A-细胞移植瘤中几乎无CDC50A+细胞，说明CDC50A+细胞在体内仍具有分化能力。　　2、从原代卵巢癌组织及腹水中成功分离出卵巢癌细胞，流式分析显示原代卵巢癌组织及腹水细胞中均存在CDC50A+细胞群。成功建立了原代卵巢癌细胞sphere培养体系，发现原代组织中CDC50A+细胞能形成sphere，并能连续传代，而CDC50A-细胞几乎不能形成sphere;免疫荧光及流式细胞学检测均证实CDC50A+细胞在原代卵巢癌sphere中的表达显著增高。体内动物实验进一步验证了原代卵巢癌CDC50A+细胞体内成瘤能力明显强于CDC50A-细胞，103个CDC50A+细胞仍能使NSG小鼠成瘤，而至少105个CDC50A-细胞才能使NSG小鼠成瘤。CDC50A+细胞移植瘤能在小鼠体内连续传代，而CDC50A-细胞移植瘤不能传代；HE染色显示原代CDC50A+细胞移植瘤与患者组织学类型保持一致。流式分析显示原代CDC50A+细胞移植瘤中CDC50A阳性率保持不变，而CDC50A-细胞移植瘤中几乎无CDC50A+细胞，说明原代CDC50A+细胞在体内仍具有分化能力。　　3、MTT法对细胞耐药性的检测发现，在SKOV3和ES2细胞系中CDC50A+细胞对顺铂的耐药性明显高于CDC50A-细胞。流式细胞学检测发现，不同浓度的顺铂作用后的SKOV3细胞后，细胞总数减少，CDC50A阳性率却逐渐增高，而且CDC50A+细胞绝对数基本不变。分析同一患者先期化疗前后卵巢癌组织中CDC50A阳性率，发现顺铂化疗后CDC50A+细胞比例显著增高。动物实验显示，接受顺铂化疗后的小鼠移植瘤增长速度显著慢于未治疗组，而移植瘤中CDC50A阳性率却显著高于未治疗组，进一步证明了顺铂对CDC50A具有富集作用。　　4、流式细胞学方法分析发现，EOC患者卵巢癌转移灶中CDC50A+细胞比例显著高于原位灶。对处于临床治疗不同阶段的EOC患者组织中CDC50A+细胞比例分析发现，CDC50A+细胞在初治手术患者中平均比例为1.47%，在先期化疗患者中为9.76%，而在复发的患者中为13.35%。免疫组化分析发现76例EOC患者中22例患者CDC50A蛋白高表达，54例患者CDC50A蛋白低表达或阴性表达。Logistic回归分析发现CDC50A蛋白表达和术后残余病灶是影响患者耐药的独立因素。Kaplan-Meier分析证实CDC50A蛋白高表达患者无进展生存时间(PFS)显著低于CDC50A蛋白低表达患者，中位无进展生存时间分别为10个月和17个月。Cox多元回归模型分析显示卵巢癌FIGO分期和CDC50A蛋白表达是影响PFS独立因素，CDC50A蛋白高表达患者发生卵巢癌复发的风险是低表达患者的2.85倍(95% CI1.32-6.16，p<0.01)。　　5、采用不同浓度的雌激素作用CDC50A+细胞，发现其对sphere的生长及自我更新能力均无显著影响。回顾性病例分析显示：HRT不是PFS及OS的独立影响因素，而且不同HRT方案对EOC患者预后无明显影响。残余病灶大小及FIGO分期是影响无进展生存期的独立因素。FIGO分期还是影响总生存期的独立因素。　　结论　　1、CDC50A+细胞在六种卵巢癌细胞系中的表达稳定在0.4%～2%之间，符合干细胞比例。卵巢癌细胞系中CDC50A+细胞群具有体内外分化能力，sphere形成能力，自我更新能力等CSCs特性。CDC50A+细胞具有更强的肿瘤形成能力，并能在小鼠体内连续传代。　　2、EOC患者原代卵巢癌细胞中能够分离出CDC50A+细胞群，该细胞群具有体内分化能力，sphere形成能力，自我更新能力等CSCs特性。原代卵巢癌细胞中的CDC50A+细胞具有更强的致瘤能力，且能在小鼠体内连续传代。　　3、卵巢癌细胞系、原代卵巢癌细胞、以及动物实验均证实顺铂对于CDC50A+细胞具有富集作用。　　4、EOC患者卵巢癌转移灶中CDC50A+细胞比例显著高于原位灶，表明CDC50A可能与卵巢癌的转移有关。CDC50A阳性细胞的比例在复发患者中最高，其次是先期化疗患者，初治手术患者的表达比例最低，进一步说明CDC50A可能与患者耐药及复发有关。临床分析表明，CDC50A蛋白的表达是患者耐药及复发的独立影响因素，高表达CDC50A的患者具有更高的复发风险。　　5、通过体外实验发现：雌激素在维持CDC50A+卵巢癌干细胞的生长及自我更新中无显著作用，其并不是维持卵巢癌干细胞的重要因子。结合临床资料，采用回顾性病例分析发现术后激素替代治疗对卵巢癌患者的复发及生存无明显影响。

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