尾悬吊诱导骨骼肌萎缩过程中miRNA表达谱的变化研究

摘要

研究目的：　　miRNA是真核生物中广泛存在的一种长度约为21-23nt的RNA分子，可通过与mRNA的结合抑制其转录，在众多生物学过程中发挥重要作用。研究显示miRNA在肌萎缩过程中发挥重要调控作用，已有研究发现miRNAs在多种类型的肌萎缩中存在差异表达，但在失重性肌萎缩及恢复过程中miRNAs表达谱的变化未见报道。本实验拟通过尾悬吊诱导小鼠失重性肌萎缩研究miRNAs表达谱的变化，寻找失重性肌萎缩过程中具有重要调控作用的miRNAs。　　研究方法：　　以C57BL/6小鼠为实验对象，尾悬吊14天诱导失重性肌萎缩，动态分析尾悬吊及恢复过程中小鼠后肢背侧骨骼肌肌纤维横截面积及肌萎缩标志蛋白和基因表达的变化；在此基础上对小鼠比目鱼肌miRNAs进行基因芯片检测,寻找差异表达的基因，并通过qPCR对部分未见报道的miRNAs进行验证。　　研究结果：　　①14天尾悬吊过程中，小鼠后肢背侧肌重显著下降，恢复过程中逐渐升高；其中比目鱼肌重量丢失程度明显高于腓肠肌和跖肌，肌纤维横截面积显著下降。　　②小鼠比目鱼肌中肌萎缩标志基因FoxO3a、MuRF1和Atrogin-1的蛋白和mRNA表达随尾悬吊时间逐渐升高。14天尾悬吊后，FoxO3a的蛋白含量显著升高（P＜0.01），Atrogin-1的蛋白含量也显著升高（P＜0.01），MuRF1的蛋白含量在尾悬吊7天升高最明显（P＜0.05）。　　③FoxO3a、Atrogin-1和MuRF1的基因表达在尾悬吊过程中有升高趋势。FoxO3a mRNA在尾悬吊3天最高（P＜0.01），Atrogin-1 mRNA在尾悬吊7天水平最高（P＜0.01），MuRF1 mRNA在尾悬吊7天表达最高（P＜0.01）。　　④芯片结果显示，尾悬吊过程中14个miRNAs上调，2个miRNAs在尾悬吊3天和7天上调，4个miRNAs先下调后上调,22个miRNAs下调。　　⑤qRT-PCR对肌肉萎缩过程中差异表达的miRNAs进行验证，筛选出8个符合芯片结果的miRNAs。　　研究结论：　　本研究通过尾悬吊成功构建了小鼠后肢骨骼肌萎缩模型，具有废用性肌萎缩的特征，包括肌肉重量下降、肌纤维横截面积的减小和肌萎缩相关基因的升高。通过基因芯片对失重性肌萎缩形成及恢复过程中差异表达的miRNAs进行了筛选，并进一步利用qRT-PCR对差异表达的miRNAs进行了验证和分析，筛选到了在失重性肌萎缩中具有潜在调控作用的miRNAs。

目录

声明

1 前言

2 文献综述

2.1 miRNAs与骨骼肌发育

2.1.1 miRNAs的来源及功能

2.1.2 miRNAs与成肌分化

2.1.3 miRNAs与骨骼肌生理学

2.1.4 miRNAs与骨骼肌疾病

2.1.5 miRNAs与肌肉萎缩

2.2 循环miRNAs与骨骼肌发育及疾病

2.2.1 循环miRNAs的运输

2.2.2 循环miRNAs与骨骼肌病理学

2.2.3 循环miRNAs与运动

2.3 lncRNAs与骨骼肌发育及疾病

2.3.1 lncRNAs的分类

2.3.2 lncRNAs与骨骼肌基因转录

2.3.3 lncRNAs与成肌分化

2.3.4 lncRNAs与骨骼肌疾病

2.3.5 循环lncRNAs与疾病诊断

3 研究方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

3.1.2 主要仪器设备

3.1.3 主要试剂

3.2 实验方法

3.2.1 模型的建立

3.2.2 样品采集与处理

3.2.3 总RNA的提取、检测和定量

3.2.4 反转录

3.2.5 引物设计

3.2.6 qRT-PCR反应

3.2.7 全蛋白的提取、检测和定量

3.2.8 Western blotting

3.2.9 冰冻切片的制备

3.2.10 免疫荧光

3.2.11 基因芯片

3.2.12 miRNAs反转录

3.2.13 miRNAs引物设计

3.2.12 miRNAs qRT-PCR

3.3.13统计学处理

4 实验结果

4.1 小鼠肌肉萎缩模型的验证

4.1.1小鼠在尾悬吊及恢复期间体重及肌肉重量的变化

4.1.2比目鱼肌纤维横截面积在失重性肌萎缩中的变化

4.1.3失重性肌萎缩中比目鱼肌FoxO3a、Atrogin-1、MuRF1的mRNA及蛋白表达情况

4.2 比目鱼肌miRNA的表达谱变化

4.2.1比目鱼肌miRNA基因芯片结果

4.2.2比目鱼肌miRNA 表达情况

5 分析讨论

5.1尾悬吊诱导小鼠肌肉萎缩模型的构建评估

5.2 失重性肌萎缩过程中比目鱼肌miRNAs表达谱的变化

6 结论

致谢

参考文献

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果