中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族克隆、分析及其功能鉴定

摘要

昆虫在长期的进化过程中,逐渐形成了一套完整的化学感受系统,在这个感受系统中,化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)起到非常重要的作用。中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)作为我国的本土蜜蜂,具有抗寒、抗逆、适应性强、出勤时间长、能利用零星蜜源等特点,在传粉授粉方面具有更优越的作用,并且中蜂具有抗螨、病虫害发生较少和嗅觉敏锐等优点,这均是西方蜜蜂Apis mellifera L.所不能及的。为此,本文成功克隆了中华蜜蜂化学感受蛋白基因家族全部6条基因序列,并对其序列进行了分析,进而利用分子生物学手段对中蜂CSPs进行研究,为CSPs的生物学功能研究提供参考。
　　1、利用RT-PCR技术扩增、克隆获得中蜂CSPs基因家族序列的开放阅读框(ORF),新克隆5条基因(Ac-CSP1、Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6)的GenBank登录号分别为:FJ157352、FJ157353、JQ979432、JQ979433和JQ979434,开放阅读框分别为351、354、387、315和378 bp,分别编码116、117、128、104和125个氨基酸残基,预测蛋白质分子量分别为13.85、13.01、14.61、12.46和14.63 kD,等电点分别为4.89、8.86、4.53、9.60和8.71,且均具有4个保守的半胱氨酸残基,均符合昆虫CSPs的一般生化特征。中蜂与意蜂CSPs同源基因家族间具有高达95％~99%的相似性。
　　2、利用real-time PCR技术对中蜂各CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同组织表达特征进行研究,结果显示,Ac-CSP1、2、3、4在卵、幼虫和蛹期几乎不表达,其中Ac-CSP1、2、4在触角中表达量最高,而Ac-CSP3在翅中表达量最高;Ac-CSP5在中蜂各个发育历期的表达量几乎相同;Ac-CSP6蛹期有较高表达,其余时期不表达。与意蜂各基因的表达谱在整体相似的情况下局部又存在着某些差异。
　　3、对中蜂主要化学感受蛋白Ac-CSP1、Ac-CSP2和Ac-CSP4进行了原核表达,三者均为上清表达,通过梯度镍NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化获得目的蛋白。
　　4、纯化后的Ac-CSPs蛋白应用荧光光谱法研究其与配基的结合能力。结果表明:1-NPN与Ac-CSPs的解离常数分别为Ac-CSP11.24μmol/L、Ac-CSP21.25μmol/L、Ac-CSP42.99μmol/L。在23种化学配基的结合实验中,7种配基可将三种蛋白与1-NPN的相对荧光值竞争至50%以下,其中花香物质β-紫罗兰酮具有较强的竞争能力,能够将三种蛋白与1-NPN的相对荧光值竞争至10%以下,并且花香物质3,4-二甲基苯甲醛和水杨酸甲酯也有较好的竞争能力,结合中蜂Ac-CSP1,Ac-CSP2和Ac-CSP4的表达谱特征:在中蜂发育早期(卵、幼虫和蛹)均几乎不表达,推测这三种蛋白可能参与工蜂搜寻蜜粉源的行为,可以作为气味分子的运载体行驶一定的嗅觉功能。

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表清单

1 绪论

1.1 中华蜜蜂概述

1.2 昆虫化学感受蛋白概述

1.3 蜜蜂CSPs的研究进展

1.4 立题依据

1.5 论文的内容安排

2 中华蜜蜂CSPs基因家族克隆与分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 本章小结

3 中蜂CSPs基因转录时空表达

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 本章小结

4 中华蜜蜂主要CSPs基因的原核表达

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 本章小结

5 中蜂主要CSPs基因与配基结合

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 本章小结

6 总结

6.1 研究总结

6.2 课题展望

参考文献

作者简介