几种淡水鱼过敏原小清蛋白的纯化鉴定及性质研究

摘要

鱼类产品因为其丰富的蛋白质和脂肪酸而成为人们喜爱的食物，然而鱼类中的过敏原也成为威胁人类健康的一个重要来源。研究证明，淡水鱼的主要过敏原是小清蛋白，因而小清蛋白的研究尤为重要。
　　本研究以几种淡水鲤科鱼类肌肉为原材料，建立一种快速纯化小清蛋白的方法，即煮沸，两次三氯乙酸（TCA）沉淀进行初步纯化。煮沸可以去除大部分杂蛋白，两次 TCA沉淀后小清蛋白大量富集，只有一条杂蛋白条带。用Sephacryl S-200 HR丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析进一步纯化，得到了高纯度（>90％）的淡水鱼小清蛋白。由于高纯度小清蛋白在紫外扫描时有特征吸收峰，本实验中吸收值图谱显示纯化的蛋白在200nm-350nm有特征吸收峰，证明了纯化出的蛋白是高纯度的小清蛋白。并用飞行时间串联质谱分析得到了纯化蛋白的进一步生物学信息。
　　本实验使用能够生产小清蛋白EG8单克隆抗体的杂交瘤细胞来制备小清蛋白单克隆抗体。将杂交瘤细胞免疫小鼠制备腹水，分离纯化后得到的小清蛋白单克隆抗体效价≥80000，并且特异性良好。将纯化的小清蛋白单克隆抗体进行电泳和免疫印迹分析，结果显示生产的单克隆抗体纯度较高。
　　采用竞争抑制ELISA和免疫印迹研究了鲤鱼小清蛋白和鲫鱼，鲢鱼，草鱼粗提蛋白之间的免疫交叉反应。免疫印迹结果说明确实有交叉反应发生，反应的分子量在12KDa左右。进一步使用竞争抑制ELISA曲线计算交叉反应率，最后发现鲤鱼小清蛋白和草鱼，鲫鱼，鲢鱼粗提蛋白之间的交叉反应率分别为83.34%，96.35%，60.93%。
　　最后本文对纯化的鲤鱼和鲢鱼小清蛋白进行体外模拟胃肠液分析。在胃蛋白酶作用下，鲤鱼和鲢鱼小清蛋白都发生快速降解，降解条带的分子量较小，但鲢鱼降解速度比鲤鱼慢，而在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，鲤鱼和鲢鱼小清蛋白都比较稳定。进一步用抑制性ELISA来分析鲤鱼，鲢鱼小清蛋白的胃肠液消化产物致敏性的变化，结果显示，鲤鱼,鲢鱼小清蛋白在和胃蛋白酶反应1h后，其消化产物的致敏性有比较大的降低，随着消化产物浓度的稀释，致敏性也随之降低。鲢鱼小清蛋白致敏性降低的较鲤鱼少。抑制性EILISA曲线结果显示胃蛋白酶对于小清蛋白的致敏性虽然有较大的破坏，但是仍然保留了一定的致敏性。两种鱼小清蛋白对于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶则表现出了很大的耐受性，致敏性和对照相比只有比较小的下降。在分析鲤鱼小清蛋白pH稳定性时，发现在pH为2.0左右时，小清蛋白发生降解，但在碱性溶液中相对稳定。超声处理后的小清蛋白没有发生明显降解。

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1 绪论

1.1 食物过敏原

1.2 食物过敏反应及其免疫学机制

1.3 食物过敏原检测技术

1.4 淡水鱼过敏

1.5 食物脱敏技术

1.6 本文研究目的与意义

2 淡水鱼过敏原小清蛋白的纯化及质谱鉴定

2.1 材料与设备

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论与分析

3 小清蛋白单克隆抗体的生产

3.1 材料与设备

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论与分析

4 淡水鱼过敏原小清蛋白的免疫交叉反应

4.1 材料与设备

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论与分析

5 淡水鱼小清蛋白的稳定性分析

5.1 材料与试剂

5.2 实验方法

5.3 结果

5.5 讨论与分析

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

作者简历