苹果叶中活性成分的分离分析及活性评价研究

摘要

天然抗氧化剂具有高效、低毒和生物相容性好等优点，正逐步取代合成抗氧化剂应用于化妆品、食品和医药等领域。植物体内的多酚是一种天然抗氧化剂，具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等多种生物功效，在预防和治疗糖尿病、心血管疾病、癌症以及退行性疾病如阿尔茨海默症等很多慢性人类疾病方面具有很好的研究价值。农业废弃物苹果叶中含有大量的多酚，苹果叶的再利用可以增加苹果产业的附加经济价值。苹果叶中多酚组成及含量的研究已有一些报道，但其分离纯化工艺、多酚单体和配伍的生物活性、多酚的资源化利用等均有待深入研究。因此，本论文围绕着苹果叶中活性成分多酚的提取工艺、分离纯化和资源化利用以及活性评价等方面展开了研究，主要研究结果如下:　　1.采用逐级回流有机溶剂提取法分别制备了苹果叶的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和75％乙醇提取物。紫外-可见分光光度法测定了各提取物的总酚和总黄酮含量以及抗氧化活性(清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和2，2'-二氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）阳离子自由基的能力，铁离子还原抗氧化能力），75％乙醇提取物中总酚和总黄酮含量最高、抗氧化活性最强，总酚和总黄酮的含量与抗氧化活性呈正相关。采用DPPH自由基清除法与高效液相色谱(HPLC)相结合快速筛选75％乙醇提取物中的抗氧化多酚，并采用液相色谱质谱联用技术鉴定出五种主要抗氧化多酚分别是根皮素-2'-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷。　　2.采用高速逆流色谱(HSCCC)与制备型HPLC（prep-HPLC）相结合分离纯化苹果叶中的五种主要多酚。将Derringer色谱响应函数与响应面法相结合，对HSCCC分离参数进行了优化，预测最佳HSCCC工艺为流速2.10mL/min、转速725rpm和温度25℃。在最优条件下，一次从约200mg的75％乙醇提取物中分离得到2.13mg槲皮素-3-O-葡萄糖苷、2.01mg槲皮素-3-O-鼠李糖苷、1.89mg槲皮素-3-O-木糖苷（纯度均90％以上）以及20.31mg根皮素-2'-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷的混合物，采用prep-HPLC对混合物进一步分离，同时精制另外三种化合物至纯度大于99％。对根皮素-2'-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-木糖苷进行定性定量分析、均匀性检验、稳定性检验和八家实验室纯度定值，最终根皮素-2'-O-葡萄糖苷的纯度为（99.63±0.09）％，槲皮素-3-O-木糖苷的纯度为(98.89±0.06)％，正在申报国家标准样品。建立苹果渣等产品中根皮素-2'-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-木糖苷的HPLC检测方法，该方法稳定、重现性好，正在申报国家标准。　　3.采用DPPH自由基清除法测定了五种苹果叶多酚单体根皮素-2'-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷的抗氧化活性，四种槲皮素糖苷类化合物的抗氧化活性较强，特别是槲皮素-3-O-葡萄糖苷(IC502.92mg/L)，但苹果的特征性高含量组分根皮素-2'-O-葡萄糖苷的抗氧化活性相对较弱(IC50119.19mg/L)。采用加和法考察了槲皮素-3-O-葡萄糖苷与根皮素-2'-O-葡萄糖苷、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)在浓度比1∶25、1∶5、1∶1、5∶1、25∶1配伍下的抗氧化协同作用，结果显示，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和根皮素-2'-O-葡萄糖苷、BHT在各比例下均表现出抗氧化协同作用，且比例为1∶1时协同作用最强，其机理是槲皮素-3-O-葡萄糖苷可促使抗氧化活性测试中根皮素-2'-O-葡萄糖苷和BHT的再生。采用过氧化氢诱导氧化损伤的小鼠海马神经元作为体外细胞模型，考察五种苹果叶多酚单体及其配伍对氧化损伤的抑制作用，0.5mg/L和1.0mg/L的槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖苷均显著抑制过氧化氢诱导的氧化损伤，但是槲皮素-3-O-葡萄糖苷和根皮素-2'-O-葡萄糖苷、BHT仅表现为加和作用。　　4.以有机酸（4-羟基苯乙酸、对香豆酸、阿魏酸和苯甲酸）、生物碱（黄连碱和小檗碱）及黄酮（槲皮素-3-O-鼠李糖苷、紫云英苷和槲皮素）为对照品，构建了一种快速、简单易行、精密度、准确度、重现性好的自动化在线DPPH-HPLC方法，该方法适合于大量复杂样品中高含量抗氧化活性成分的高通量筛选，可以直观量化各成分的抗氧化能力。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章绪论

1．1苹果资源研究概况

1．2苹果多酚的研究进展

1．2．1苹果多酚的主要分类、结构特征及分布

1．2．2苹果多酚的提取技术

1．2．3苹果多酚的分离纯化技术

1．2．4苹果多酚的检测技术

1．2．5苹果多酚的生物活性

1．2．6苹果多酚的资源化利用

1．3苹果多酚的抗氧化活性研究

1．3．1抗氧化活性评价方法

1．3．2多酚间抗氧化相互作用研究

1．3．3在线抗氧化活性成分的评价方法

1．4选题目的和主要研究内容

第二章苹果叶中多酚的提取鉴定及抗氧化活性评价

2．1引言

2．2实验部分

2．2．1实验材料、试剂及仪器

2．2．2苹果叶粗提物的制备

2．2．3苹果叶粗提物中总酚和总黄酮含量的测定

2．2．4苹果叶粗提物的抗氧化活性评价

2．2．5多酚提取物中抗氧化活性成分的筛选

2．2．6多酚提取物中抗氧化活性成分的LC／MS-IT-TOF鉴定

2．3结果与讨论

2．3．1多酚提取物中的总酚和总黄酮含量

2．3．2苹果叶粗提物的体外抗氧化作用

2．3．3 75％乙醇粗提物中的抗氧化活性成分

2．3．4抗氧化活性成分的LC／MS-IT-TOF组分分析

2．4小结

第三章苹果叶中多酚的分离纯化及资源化利用

3．1引言

3．2实验部分

3．2．1实验试剂和仪器

3．2．2苹果叶多酚提取物的制备

3．2．3苹果叶多酚提取物的HSCCC分离纯化

3．2．4未分离馏分的prep-HPLC分离纯化

3．2．5多酚化合物的结构确认

3．2．6国家标准样品的研制

3．2．7 HPLC检测方法国家标准的建立

3．3结果与讨论

3．3．1 HSCCC法分离纯化苹果叶中的多酚类化合物

3．3．2 Prep-HPLC进一步分离纯化馏分Ⅱ

3．3．3结构鉴定

3．3．4研制成国家标准样品

3．3．5建立HPLC检测方法国家标准

3．4小结

第四章苹果叶中多酚单体的抗氧化活性及相互作用评价

4．1引言

4．2实验部分

4．2．1实验材料、试剂及仪器

4．2．2 DPPH自由基清除能力的测定

4．2．3抑制过氧化氢诱导的小鼠海马神经元氧化损伤的测定

4．2．4数据处理

4．3结果与讨论

4．3．1五种多酚单体对DPPH自由基的清除能力

4．3．2各比例配伍抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力

4．3．3五种多酚单体对小鼠海马神经元的细胞毒性

4．3．4五种多酚单体抑制过氧化氢诱导的小鼠海马神经元细胞氧化损伤

4．3．4各比例配伍抗氧化剂抑制过氧化氢诱导的小鼠海马神经元细胞氧化损伤

4．4小结

第五章基于在线DPPH-HPLC技术对天然产物中抗氧化活性成分的高通量筛选

5．1引言

5．2实验部分

5．2．1实验材料、试剂及仪器

5．2．2甘蔗皮、黄连及苹果叶提取物的制备

5．2．3 DPPH、对照品及提取物样品溶液的配制

5．2．5自动化在线DPPH-HPLC法的验证

5．2．6自动化在线DPPH-HPLC法在天然产物中的应用

5．3结果与讨论

5．3．1九种对照品HPLC分析方法的建立及验证

5．3．2建立自动化在线DPPH-HPLC系方法

5．3．3验证自动化在线DPPH-HPLC方法

5．3．4将自动化在线DPPH-HPLC方法应用于天然产物

5．4小结

第六章结论与创新点

6．1主要结论

6．2创新点

6．3展望

参考文献

研究成果及其发表的学术论文

致谢

作者及其导师简介