日本血吸虫成虫抗原筛选、鉴定及无细胞体系表达

摘要

血吸虫病仍然是全球危害最为严重的热带病之一。我国经过50多年积极防治，感染率和感染度均已降至较低水平，从人粪便样本中查找虫卵等病原学查病方法不仅费时费力，并且敏感性低，已不再适用于大规模的人群调查。血清免疫学诊断方法具有简易、快速、灵敏等优点，已在全国血吸虫病查治病中起重要作用。目前现场应用的免疫诊断方法均采用虫源性粗抗原检测抗体，虽然敏感性高，但与其它吸虫存在交叉反应，并且虫源性抗原还存在来源和标准化困难等问题。血吸虫基因组和蛋白质组研究积累的庞大信息资料，加上免疫蛋白质组学技术的快速发展，为发现日本血吸虫特异性诊断抗原带来新的生机。
　　目的：一、应用免疫蛋白质组学技术整体研究日本血吸虫成虫可溶性蛋白质中全套抗原，获得具有诊断价值的抗原蛋白质，以期解决血吸虫病免疫诊断中抗原特异性问题。二、创建日本血吸虫抗原蛋白质的体外麦胚无细胞体系表达方法，以期获得保持良好抗原性的重组蛋白，解决日本血吸虫病诊断抗原的来源和标准化难等问题。
　　方法：从人工感染日本血吸虫的家兔体内收集成虫，用PBS漂洗后在冰浴上研磨成匀浆、超声粉碎，然后低温高速离心制备血吸虫成虫可溶性蛋白质(Soluble adultworm protein，SAWP)。用双向凝胶电泳（2-DE）分离蛋白质，每样本做3块平行2-DE胶，一块胶用于硝酸银染色，两块胶用于转膜作Western blot检测。两张转印膜用5％脱脂奶粉封闭后，分别与健康兔IgG和感染兔IgG孵育，以AP标记的抗兔IgG多抗为二抗，用NBT-BCIP进行显色。选出膜上的阳性反应点，在染色胶找匹配的抗原蛋白质点。胶上的抗原蛋白点经挖点、脱色和胰蛋白酶消化后进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，并通过搜数据库，获得抗原蛋白质的相关信息资料。
　　本研究探索三种免疫捕捉富集抗原的方法。直接免疫捕捉法:分别选用CNBr-activated Sepharose、氨基修饰磁珠和羧基修饰磁珠3种固相载体共价结合日本血吸虫感染兔IgG，以此免疫捕捉SAWP中的抗原蛋白质，洗脱液用SDS-PAGE分离蛋白质，Western blot检测分析富集抗原。间接免疫捕捉法:将SPA与Sepharose共价结合制成亲和层析柱，先将感染兔血清IgG过柱，SPA特异性结合兔血清IgG，然后再将SAWP过柱，SPA通过感染兔IgG间接免疫捕捉抗原蛋白质，洗脱液用SDS-PAGE分离和Western blot检测分析。免疫共沉淀富集抗原:将感染兔血清IgG与SAWP一起孵育，抗原与IgG抗体特异性结合形成免疫复合物(IC)，加适量PEG-6000沉淀IC，使抗原从复杂样本富集出来，再用SDS-PAGE和Western blot分析富集效果。
　　体外麦胚无细胞体系表达体被抗原和ER calcistorin。以日本血吸虫RNA为模板，反转录合成cDNA，根据Genbank数据库基因序列设计引物，PCR扩增这两个抗原蛋白质的ORF;酶切后连接到pIVEX1.4WG载体的多克隆位点，获得重组表达载体;麦胚无细胞表达体系中加入构建的重组质粒，24℃条件下表达24小时，收集表达产物，用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白表达量及其抗原性。
　　结果应用经典2D Western blot等免疫蛋白质组学技术，分别从日本血吸虫雄虫和雌虫可溶性蛋白质中筛选出24个和17个抗原蛋白质点，用MALDI-TOF/TOF成功鉴定19个雄虫抗原蛋白质点，其中2个蛋白质是功能未知的SJCHGC06614异构体，另2个蛋白质是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β-2异构体。成功鉴定13个雌虫抗原蛋白质点，其中3个蛋白质是二硫键异构酶3前体的异构体，2个蛋白质是尿苷二磷酸-半乳糖-4-异构酶的异构体。
　　以Sepharose、羧基修饰磁珠和氨基修饰磁珠为固相载体的直接免疫捕捉法分别获得3条、5条、6条阳性反应条带，在SDS-PAGE胶上找到0条、1条、3条相应的抗原蛋白质条带;SPA-Sepharose间接免疫捕捉法获得7条阳性反应条带，在染色胶上相应有6条蛋白质条带;免疫共沉淀富集的抗原显示有11个阳性反应条带，在染色胶上获得6条蛋白质条带。
　　血吸虫体被抗原和ER calcistorin蛋白质均可通过麦胚无细胞体系成功表达;Western blot结果显示麦胚无细胞体系表达的体被抗原蛋白质有较好的抗原性，而ER calcistorin未取得预期抗原性。
　　结论2-DE、Western blot和生物质谱鉴定相结合是经典的免疫蛋白质组学技术体系，具有分辩率高、分离完整的蛋白质分子，可发现未知的全新抗原蛋白质等优点，用于筛选、鉴定血吸虫成虫诊断抗原切实可行，但该技术体系存在一些局限性。与直接免疫捕捉法相比，免疫共沉淀、间接免疫捕捉法富集抗原的效率较高，值得进一步深入优化条件;三种固相载体中，氨基修饰磁珠与感染兔IgG共价结合用于抗原富集效果较好，若能解决IgG定向结合等技术问题，可望进一步提高抗原富集效果。日本血吸虫体被抗原和ER calcistorin基因均可在麦胚无细胞体系中表达，重组表达的体被抗原具有较好的抗原性，是潜在的免疫诊断和疫苗候选抗原分子。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分 用基于凝胶电泳的免疫蛋白质组学技术筛选鉴定日本血吸虫抗原

材料与方法

1．材料

2．方法

结果与分析

1．两种方法制各雌雄成虫蛋白质样本的2-DE胶图比较分析

2．雌雄成虫蛋白质样本不同上样量的2-DE分离效果比较

3．雌虫可溶性特异抗原筛检

4．MALDI-TOF／TOF串联质谱鉴定雌虫可溶性抗原并搜库

5．雄虫可溶性特异抗原筛检

6．MALDI-TOF／TOF串联质谱鉴定雄虫可溶性抗原并搜库

讨论与建议

1．根据研究目的选择合适的蛋白质样本制备方法

2．免疫蛋白质组研究中应适当增加双向电泳蛋白质上样量

3．日本血吸虫雌雄成虫可溶性抗原蛋白质组存在较大差异

4．2-DE／2-D Western blot／质谱联用尚存在的局限性

第二部分 建立免疫捕捉富集抗原方法

材料与方法

1．材料

2．方法

结果与分析

1．亲和层析纯化感染兔IgG

2．直接法免疫捕捉抗原

3．间接法免疫捕捉抗原

4．免疫共沉淀富集抗原

讨论与建议

第三部分 无细胞体系表达抗原蛋白质

材料与方法

1．材料

2．方法

结果与分析

1 日本血吸虫成虫RNA提取

2 目的基因扩增

3 菌落PCR、双酶切鉴定和测序鉴定阳性克隆

4 无细胞体系表达的重组蛋白SDS-PAGE分析

5 无细胞体系表达的重组蛋白Western blot分析

讨论与建议

1．抗原蛋白抗原性分析

2．无细胞表达体系的分析

结论

参考文献

致谢

综述及参考文献 免疫蛋白质组学技术在寄生虫病诊断抗原筛选中的应用

附件1 攻读学位期间发表论文目录

附件2 pIVEX 1．4 WG质粒图谱