不同佐剂对治疗用重组人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫增强作用的研究

摘要

本课题的研究任务是开发治疗宫颈癌的重组融合蛋白疫苗HPV16L2E6E7(简称HPV16L2E6E7)，融合蛋白疫苗有较好的安全性，但免疫原性弱是研制该类疫苗的障碍。根据国内外研究发展的方向和课题组前期研究，证实HPV16L2E6E7有一定的治疗效果，若配伍具有免疫增强作用的佐剂，将起到更好的治疗作用。因此，本次研究尝试将Al(OH)3、非甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN）及多西紫衫醇与HPV16L2E6E7配伍，观察这三种免疫佐剂能否促进该疫苗的免疫效果。
　　本次试验从免疫学指标测定和肿瘤生长抑制试验两方面对Al(OH)3、CpG-ODN和多西紫杉醇佐剂进行评价。免疫学指标测定（分别评价）:将6～8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分成①佐剂对照组，②佐剂+HPV16L2E6E7组，③HPV16L2E6E7组，每组36只;大腿肌肉注射免疫，HPV16L2E6E7剂量为120μg/只，佐剂剂量为(Al(OH)385.7μg/只，CpG-ODN10μg/只，多西紫杉醇100μg/只），免疫程序为0、3、7天;间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体滴度，ELISPOT法检测脾细胞分泌IFN-γ水平，分别评价小鼠机体体液及细胞免疫效果。肿瘤生长抑制试验:将80只6～8周龄雌性C57BL/6小鼠于右侧腹股沟处皮下接种TC-1肿瘤细胞（1×104/只），24h后，随机分成①PBS组，②Al(OH)3组，③CpG-ODN组，④多西紫杉醇组，⑤Al(OH)3+HPV16L2E6E7组，⑥CpG-ODN+HPV16L2E6E7组，⑦多西紫杉醇+HPV16L2E6E7组，⑧HPV16L2E6E7组8组，每组10只;小鼠大腿肌肉注射免疫，HPV16L2E6E7剂量为120μg/只，佐剂剂量为(Al(OH)385.7μg/只，CpG-ODN10μg/只，多西紫杉醇100μg/只），记接种第一针当天为0天，免疫程序为0、3、7天，对照组不给药;免疫后每周观察两次，记录肿瘤形成时间，肿瘤大小，统计抑瘤率。
　　Al(OH)3佐剂的评价结果:Al(OH)3与HPV16L2E6E7以0.7∶1吸附时能吸附完全，蛋白性质较稳定;Al(OH)3+HPV16L2E6E7与HPV16L2E6E7都能诱导HPV16L2E6E7特异性IgG抗体产生，Al(OH)3+HPV16L2E6E7组的IgG抗体滴度在10天、14天与HPV16L2E6E7组无明显差异(t1=1.34，t2=0.54，P＞0.05)，14天到42天显著高于HPV16L2E6E7组(t3=9.30，t4=8.06，t5=7.82，t6=5.53， P＜0.01)，说明Al(OH)3能够提高HPV16L2E6E7的体液免疫效果;Al(OH)3+HPV16L2E6E7与HPV16L2E6E7都能诱导E7特异性IFN-γ分泌，两组变化趋势相近，都在14天达到较高值，Al(OH)3+HPV16L2E6E7组IFN-γ水平显著高于HPV16L2E6E7组(F1=103.80, F2=29.37, F3=11.84, P＜0.01), Al(OH)3能够促进脾细胞分泌IFN-γ; Al(OH)3+HPV16L2E6E7组抑瘤率为40％，HPV16L2E6E7组抑瘤率为60％，两组差异不显著(P=0.33，P＞0.05)。
　　CpG-ODN佐剂的评价结果:CpG-ODN+HPV16L2E6E7组IgG抗体水平在10天、14天、21天及42天显著高于HPV16L2E6E7组(t1=6.16，t2=6.69，t3=4.57，t6=7.91，P＜0.01)，28天抗体差异无统计学意义(t4=1.58，P＞0.05)，35天两组抗体水平持平，总体上CpG-ODN+HPV16L2E6E7诱导的特异性抗体滴度高于HPV16L2E6E7组;CpG-ODN+HPV16L2E6E7组的IFN-γ水平在免疫后21天、28天显著高于HPV16L2E6E7组(F2=177.32，F3=36.23，P＜0.01)，在21天达到最高值，说明CpG-ODN能够提高HPV16L2E6E7的E7特异性细胞免疫应答;CpG-ODN+HPV16L2E6E7组抑瘤率为100％，HPV16L2E6E7组抑瘤率为60％(P=0.04，P＜0.05)，CpG-ODN佐剂能够有效加强HPV16L2E6E7的抑瘤作用。
　　多西紫杉醇佐剂的评价结果:多西紫杉醇+HPV16L2E6E7组IgG抗体水平在免疫后10天、14天、21天显著低于HPV16L2E6E7组(t1=5.13，t2=3.86，t3=4.37，P＜0.01)，在28天、35天、42天，两组抗体水平无明显差异，总体上多西紫杉醇+HPV16L2E6E7诱导的特异性抗体低于HPV16L2E6E7组;多西紫杉醇+HPV16L2E6E7组的IFN-γ水平在14天、21天、28天显著低于HPV16L2E6E7组(F1=30.94，F2=15.64，F3=40.30，P＜0.01)，说明多西紫杉醇减弱了HPV16L2E6E7细胞免疫应答;多西紫杉醇+HPV16L2E6E7组抑瘤率为10％，HPV16L2E6E7组抑瘤率为60％(P=0.03，P＜0.05)，加多西紫杉醇，HPV16L2E6E7抑瘤效果降低。
　　综上所述，将Al(OH)3、CpG-ODN与HPV16L2E6E7配伍，小鼠的免疫学指标都得到提高，其中CpG-ODN有效降低了荷瘤小鼠的成瘤率;将多西紫杉醇与HPV16L2E6E7配伍，没有起到免疫佐剂的作用。试验结果表明CpG-ODN显示出更为全面的免疫增强作用，值得进一步深入研究。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1．1 HPV16L2E6E7融合蛋白

1．2 Al(OH)3

1．3 CpG-ODN

1．4 多西紫杉醇

1．5 肿瘤细胞株

1．6 实验动物

1．7 主要试剂

1．8 主要仪器

2 方法

2．1 研究路线图

2．2 Al(OH)3吸附HPV16L2E6E7融合蛋白

2．3 免疫学指标测定

2．4 肿瘤生长抑制试验

2．5 统计学方法

结果与分析

1 Al(OH)3对人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫佐剂作用

1．1 Al(OH)3吸附HPV16L2E6E7融合蛋白

1．2 血清特异性IgG抗体检测

1．3 脾细胞分泌E7特异性IFN-γ水平

1．4 肿瘤生长抑制实验

1．5 小结

2 CpG-ODN对人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫佐剂作用

2．1 血清中特异性抗体的检测

2．2 脾细胞分泌E7特异性IFN-γ水平

2．3 肿瘤生长抑制实验

2．4 小结

3 多西紫杉醇对人乳头瘤病毒16型L2E6E7融合蛋白免疫佐剂作用

3．1 血清中特异性抗体的检测

3．2 脾细胞分泌E7特异性IFN-γ水平

3．3 肿瘤生长抑制实验

3．4 小结

讨论与建议

1．Al(OH)3与HPV16L2E6E7融合蛋白

2．CpG-ODN与HPV16L2E6E7融合蛋白

3．多西紫杉醇与HPV16L2E6E7融合蛋白

4．Al(OH)3与CpG-ODN比较

5．展望

致谢

参考文献

附表1 Al(OH)3联合HPV16L2E6E7的特异性IgG抗体水平

附表2 CpG-ODN联合HPV16L2E6E7的特异性IgG抗体水平

附表3 多西紫杉醇联合HPV16L2E6E7的特异性IgG抗体水平

附表4 不同佐剂联合HPV16L2E6E7对TC-1肿瘤细胞的生长抑制情况

综述及参考文献 重组治疗性人乳头瘤病毒16型融合蛋白疫苗及免疫佐剂的研究进展

附件1 攻读学位期间发表论文目录

附件2 攻读学位期间参与课题目录