冷冻对小鼠卵母细胞发育潜能及细胞骨架的影响

摘要

目的：通过比较不同冷冻方法(SOPS玻璃化冷冻和慢速冷冻)及卵丘细胞对小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响，以寻求最佳的卵子冷冻方法，为建立人类卵子库提供理论和实验依据。 方法：实验所用不同成熟阶段的卵子(MII和GV)均来自体重为20～25克的昆明雌性小鼠。分别以SOPS玻璃化冷冻法(以乙二醇、二甲基亚砜及蔗糖为冷冻保护剂)及慢速冷冻法(以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂)冷冻保存，分析不同冷冻方法对不同成熟阶段卵子冷冻结果的影响，以确定最适合的冷冻保存方法，并以此为依据，选择最终的卵子冷冻保存方法。确定冷冻方法后，以该冷冻方法分别冷冻保存有无卵丘细胞的卵子(COC及DO)及体外培养成熟之前或之后的GV卵。解冻复苏后，MII卵经体外培养1～2h，GV卵则经体外培养成熟(IVM)后，分别作体外受精(IVF)、胚胎培养或固定作免疫荧光标记，统计复苏率，成熟率、受精率、囊胚率等常规胚胎学指标及纺锤体等细胞骨架指标。最后，MⅡ卵在经玻璃化冷冻或仅经玻璃化冷冻保护剂处理后体外孵化0h、1h和3h后，分析卵子细胞骨架指标的变化趋势。 结果： 第一部分： (一)不同冷冻方法对卵子的影响： 玻璃化冷冻MII卵和GV卵的复苏率分别为86.49％和85.95％，均显著高于慢速冷冻组(分别为40.38％和57.14％)(P<0.01)。玻璃化冷冻MII卵和GV卵的受精率与慢速冷冻相比均无显著性差异(MⅡ：3L68％Vs.32.82％；GV：30.05％vs.28.21％，P>0．05)。玻璃化冷冻MII卵和GV卵囊胚率均显著高于慢速冷冻组(MⅡ：53.14％vs.31.25％，GV:52.5％vs.31.82％，P<0.05)。玻璃化冷冻和慢速冷冻GV卵分别获得83.2％和80.56％的成熟率，和对照组及两组之间相比均无显著性差异(P>0.05)。玻璃化冷冻MII卵的纺锤体和染色体二者均正常率高于慢速冷冻组(52.38％vs.30％)，但无显著性差异(P>0.05)。玻璃化冷冻GV卵的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体均正常率均高于慢速冷冻组(70.97％vs.63.6496，61.2996vs.36.3696及61.29％vs.36.36％)，但均无显著性差异(P>0.05)。 (二)两种冷冻方法对不同成熟阶段卵子的影响： 玻璃化冷冻：MII卵的复苏率、受精率及囊胚率和GV卵相比，均无显著性差异(P>0．05)；GV卵纺锤体、染色体及纺锤体和染色体均正常率均高于MⅡ卵，分别为70.9796vs.57.14％、61.29％vs.57.1496及61.2996vs.52.3896，但均无显著性差异(P>0.05)。慢速冷冻：MII卵复苏率显著低于GV卵(40．38％vs．57．1496，P<0.01)，MII卵和GV卵的受精率、囊胚率及细胞骨架正常率均无显著性差异(P>0.05)。 综合以上参数，确定玻璃化冷冻法更有利于卵子冷冻保存，并选择为下阶段卵子冷冻保存研究的最终方法。 第二部分：玻璃化冷冻对有无卵丘细胞卵子的影响 1．MⅡ-COC和GV-COC玻璃化冷冻的复苏率与各自DO的复苏率相比，分别为86.49％vs60.92％，和85.9596vs64.9396，均有显著性差异(P<0.01)。 2．玻璃化冷冻MⅡ-COC组和MⅡ-DO组的受精率和囊胚率均无显著性差异，分别为31.68％vs.31.34％和53.1496vs.52.3896(P>0.05)，GV-COC组受精率和囊胚率均高于GV-DO组，分别为30.0596vs．24.6396和52.5％Vs.42％，但均无显著性差异(P>0.05)。GV-COC组和GV-DO组的成熟率分别为83.20％和79.79％，两组相比及与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。 3．MⅡ-COC组的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体均正常率均高于MⅡ-DO组，分别为57.1496vs.4496、57.14％vs.56％及52.3896vs.36％，但均无显著性差异(P>0.05)。MII-COC和MⅡ-DO两组染色体正常率(57.140,06和56％)显著低于对照组(P<0.05)。MⅡ-DO组纺锤体和染色体均正常率与对照组相比有显著性差异(3696vs.7596，P<0.01)。GV-COC组、GV-DO组及对照组的纺锤体、染色体及纺锤体和染色体均正常率三组相比，均无显著性差异(分别为70.97％vs.61.5496vs.70.83％、61.29％vs.61.54％vs.7596及61.29％vs.53.85％vs.62.5％，P>0.5)。 第三部分：GV卵冷冻时机的选择 1．GV冷冻组和IVM-MⅡ冷冻组复苏率分别为65％和69.93％(P>0.05)。 2．GV冷冻组染色体、纺锤体及染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MII组(分别为61.54％vs.42.22％，61.54％vs.42.22％，P>0.05；53.85％vs．26.67％，P<0.05)。IVM-MII组纺锤体、染色体及纺锤体和染色体均正常率均显著低于对照组，且均有显著性差异(分别为42.22％vs.70.83％，P<0.05；42.22％vs.75％，26.67％vs.62.5％，P<0.01)。 第四部分：玻璃化冷冻卵的细胞骨架修复能力及冷冻保护剂的细胞毒性分A组(对照组)、B组、C组和D组(分别为玻璃化冻融后体外培养0h、1h和3h)及E组、F组和G组(分别为经玻璃化冷冻液处理后体外培养0h、1h和3h)共七组。 1.纺锤体正常率：B(50％)、C(66．67％)、E(52．38％)和F组(50％)均低于A(75％)、D(80％)和G组(75％)，但各组之间相比均无显著性差异(P>0.05)。 2．染色体正常率：B组显著低于A组(50％vs.87.5％，P<0.01)，E组(47.62％)和F组(50％)显著低于A组(87.5％)(P<0.01)和G组(75％)(P<0.05)。 3．纺锤体和染色体均正常率：B组显著低于A组(4L67％vs．75％，P<0．05)，E组(47．62％)和F组(45％)显著低于A组和G组(75％)(P<0．05)。B组、C组和D组及E组、F组和G组的细胞骨架正常率依次提高，且玻璃化冷冻组(B组、C组和D组)和冷冻液暴露组(E组、F组和G组)相应时段(Oh、1h及3h)比较(即B组与E组、C组与F组及D组与G组比较)均无显著性差异(P>0.05)。 结论： 1.与慢速冷冻比较，玻璃化冷冻更有利于MII及GV卵复苏和改善胚胎发育；与MⅡ卵比较，冷冻GV卵对细胞骨架损伤较小：两种冷冻方法均不影响GV卵冻融后成熟。 2．玻璃化冷冻带卵丘细胞的卵子(COC)，卵子复苏及胚胎发育能得到有效改善，且细胞骨架的冷冻损伤减少，但对冻融后卵子体外成熟无显著影响。 3．玻璃化冷冻对GV卵细胞骨架的影响比IVM-MⅡ小，故GV卵更适合先冷冻，后成熟。 4．冷冻保护剂的细胞毒性在玻璃化冷冻损伤中起主要作用，但其对细胞骨架的损伤是可逆的。

目录

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢

附录

综述 未成熟卵母细胞体外培养的临床应用研究进展