增生性玻璃体视网膜病变的蛋白质组学研究

摘要

目的：采用蛋白质组研究技术，通过双向电泳分离，比较增生性玻璃体视网膜病变(PVR)与正常人的玻璃体的蛋白质表达差异，通过质谱检测分析差异蛋白质点。寻找与鉴定PVR特异性表达的蛋白质。 方法：本研究是建立在蛋白质双向电泳(2-DE)技术和优化各类实验技术的基础上，采用2-DE联合串联质谱(MS-MS)的技术路线进行了PVR与正常人玻璃体的蛋白质组学研究。PVR(c2-d1)期的患者玻璃体和正常人的玻璃体以相同加样量进行双向凝胶电泳；一向等电聚焦，使用固相pH梯度凝胶条(IPGstritpH3-10NL)，胶内重泡胀技术，聚焦总电压时80kVh-85kVh；用二硫苏糖醇和碘乙酰胺两步平衡；二向电泳采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(13％、1.5mm均一胶)；根据上样量不同分别进行银染和考马斯亮蓝染色；用Umax透射扫描仪获取染色后的2-DE凝胶图谱；将2-DE凝胶图谱输入计算机，通过Imagemaster软件分析找到合适的差异蛋白质点；ABI4700TOF-TOF串级质谱仪鉴定与分析所找出的差异蛋白质点，得到差异蛋白质的肽质量指纹(PMF)和肽序列标签(PST)；用Matrixscience公司的Mascot软件搜索NCBInr数据库，对得到的PMF和PST与数据库进行蛋白同源查询，获取差异蛋白质的信息。结合双向凝胶电泳相应点表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等进行综合分析。 结果：PVR患者和正常人的玻璃体蛋白质表达主要分布在mw(30kd-97kd)pi(4-8)之间，Imagemaster软件分析双向电泳图谱结果，两图谱显示疾病组表达蛋白质为190±30个，而正常组表达蛋白质为260±37个。同一患者标本在不同实验批次所得的分离图谱，经过软件分析，两图谱匹配率达86.7％。PVR患者与正常人玻璃体蛋白质相比，其浓度较高，高丰度蛋白质所占的比例较大，在二维凝胶图谱中，分离清晰的蛋白点较正常人少，但两者在高丰度蛋白质高度相似。本实验所提取的正常人玻璃体蛋白质标本蛋白质分离图谱的比较也见有较好的相似性及可比性。PVR不同分期患者间玻璃体蛋白质图谱差异较小，有很大的相似性，图谱匹配率达82.1％。差异表达点79个，其中疾病组特异性表达有11个差异表达性蛋白质进行串级质谱鉴定，通过对NCBInr数据库检索，再通过表观等电点、分子量、匹配肽段和覆盖率等分析，鉴定出9个蛋白质：分别是补体C4b、甲状腺素转运蛋白，以及PR02619、Humanserumalbumininacomplexwithmyristic等7个血清相关蛋白质。 结论：建立的玻璃体蛋白提取法可以提高组织蛋白质组的提取率，提高了分离效果，有较好的重复性。PVR患者与正常人玻璃体在蛋白质的表达上存在显著的蛋白表达差异。质谱鉴定出9个差异表达蛋白质补体C4b、甲状腺素转运蛋白，以及7个血清相关蛋白可能在PVR的发病过程中起着关键性作用，为进一步进行PVR玻璃体蛋白质组学深入研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

材料与方法

结 果

分析与讨论

结 论

参考文献

附 录

致 谢

综述：补体系统在眼部疾病中的作用