7型腺病毒E1基因和5型腺病毒E1A基因的克隆及表达

摘要

目的： 为研究7型腺病毒(Ad7)E1基因在感染中的致病机制以及其EIA与5型腺病毒(Ad5)EIA功能的对比，分离了Ad7d2病毒株，构建了Ad7E1A、E1B和Ad5E1A基因的真核表达体系。为进一步探讨Ad7E1基因的肿瘤基因治疗效应及应用前景提供方法。 方法： 1、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定 以A549细胞分离培养痰液标本中的腺病毒。病毒纯化后提取基因组DNA进行BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的酶切分析。 2、pIRES-Neo-Ad7E1A重组质粒的构建，Ad7E1A基因的表达、免疫印迹分析利用重叠延伸PCR的方法，以提取的Ad7基因为模板，扩增Ad7E1A完整的基因，并将其克隆入载体质粒pIRES-Neo中构建成重组质粒pIRES-Neo-Ad7E1A。限制性内切酶和测序鉴定质粒构建是否正确。将pIRES-Neo-Ad7E1A重组质粒转染至A549细胞表达，提取RNA做RT-PCR鉴定，提取蛋白组后免疫印迹分析。 3、pIRES-Ad7E1A-E1B重组质粒的构建，Ad7E1A、E1B基因的表达利用PCR的方法，以提取的Ad7基因为模板，扩增Ad7E1B完整的基因，并将其克隆入载体质粒pIRES-Neo-Ad7E1A中构建成重组质粒pIRES-Ad7E1A-E1B。限制性内切酶和测序鉴定质粒构建是否正确。将pIRES-Ad7E1A-E1B重组质粒转染至A549细胞表达，提取RNA做RT-PCR鉴定。 4、pIRES-Neo-Ad5E1A重组质粒的构建，Ad5E1A基因的表达、免疫印迹分析利用重叠延伸PCR的方法，以提取的293细胞DNA为模板，扩增Ad5E1A完整的基因，并将其克降入载体质粒pIRES-Neo中构建成重组质粒pIRES-Neo-Ad5E1A。限制性内切酶和测序鉴定质粒构建是否正确。将pIRES-Neo-Ad5E1A重组质粒转染至A549细胞表达，提取RNA做RT-PCR鉴定，提取蛋白组后免疫印迹分析。 结果： 1、Ad的分离培养和基因组DNA提取、酶切鉴定病毒基因组DNA的BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ酶切图谱，对照国外文献，从BamHⅠ的带型初步确定本次分离的Ad毒株为Ad7d2型。 2、pIRES-Neo-Ad7E1A重组质粒的构建，Ad7E1A基因的表达、免疫印迹分析双酶切及测序结果表明pIRES-Neo-Ad7E1A表达载体构建成功。RT-PCR和免疫印迹结果显示Ad7E1A基因已被成功转染入A549细胞并产生表达。 3、pIRES-Ad7E1A-E1B重组质粒的构建，Ad7E1A、E1B基因的表达双酶切及测序结果表明pIRES-Ad7E1A-E1B表达载体构建成功。RT-PCR结果显示Ad7E1A-E1B基因已被成功转染入A549细胞并产生表达。 4、pIRES-Neo-Ad5E1A重组质粒的构建，Ad5E1A基因的表达、免疫印迹分析双酶切及测序结果表明pIRES-Neo-Ad5E1A表达载体构建成功。RT-PCR和免疫印迹结果显示Ad5E1A基因已被成功转染入A549细胞并产生表达。 结论： 本实验成功分离和鉴定了Ad7d2病毒株，并成功构建了Ad7E1A、Ad7E1A-E1B和Ad5E1A的真核表达体系，为进一步探讨Ad7E1基因的肿瘤基因治疗效应及应用前景提供方法，并为Ad7溶癌腺病毒的构建打下基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料与方法

结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述：E1A基因作为肿瘤抑制基因的研究