大肠杆菌IscA和SufA在铁硫簇生物合成中的功能研究

摘要

目的： 为研究大肠杆菌中IscA和SufA蛋白的功能，通过同源重组技术敲除大肠杆菌中编码这两个蛋白的基因iscA和sufA，得到基因缺失的双突变株，再将这两个基因分别导入双突变株中，同时运用定点突变技术将这两个蛋白上已发现的几个功能关键位点定点突变，测定这些构建菌株的生长状态，为这两个蛋白的功能研究提供实验基础。 方法： 1.大肠杆菌iscA-sufA-双突变株的构建 1)打靶载体的制备根据哈佛大学网站提供的基因敲除的引物序列，送大连宝生物公司合成，通过两步交叉PCR反应，扩增出两个基因的读码框缺失片段iscA-和sufA-，克隆到低拷贝、条件复制基因敲除质粒工具pKOV内的NotI、，SalI双酶切位点中，构建两个基因打靶载体：pKOV-iscA-和pKOV-sufA-。 2)iscA和sufA单个基因的敲除利用已构建好的打靶载体pKOV-iscA-、pKOV-sufA-进行iscA基因和sufA基因的敲除。其敲除流程是：a)使用质粒小量提取试剂盒，从含有打靶载体pKOV-iscA-和pKOV-sufA-的大肠杆菌DH5a中提取纯度较高的打靶载体pKOV-iscA-和pKOV-sufA-；b)通过冷氯化钙法转化重组频繁的大肠杆菌株MC4100；c)经过转化的大肠杆菌涂布于氯霉素/LB平板并置42℃孵育，平板上存活的菌落表明重组pKOV质粒已成功整合进入基因组DNA，因为游离质粒不会在非允许温度下复制增殖；d)存活的菌落立即被置于含5％(w/v)蔗糖的LB平板上置30℃培养以选择发生第二次重组的大肠杆菌克隆。对蔗糖抵抗且对氯霉素敏感的细菌克隆被挑选用作进一步分析，所选克隆通过针对目的基因iscA和sufA两侧序列引物的PCR方法进行筛选，如果敲除成功，PCR扩增出不含基因iscA和sufA读框的片段，相反，扩增出象亲代一样的片段，证实敲除不成功。 3)iscA和sufA两个基因的敲除通过同样的敲除流程，在iscA突变株基础上敲除sufA，得到iscA和sufA两个基因缺失的突变株iscA-sufA-。其中，敲除流程和原来不同之处是：第二次同源重组条件改为，含5％(w/v)蔗糖的LB平板置30℃厌氧培养，其它条件不变。 2.iscA和sufA基因的导入 以野生型大肠杆菌MC4100的基因组为模板，用PCR方法分别扩增出iscA和sufA基因，PCR产物经限制性内切酶NcoⅠ，EcoRⅠ酶切后克隆入表达载体pBAD构建重组质粒pBAD-iscA和pBAD-sufA。将重组质粒pBAD-iscA和pBAD-sufA分别转化入iscA-sufA-双突变株，构建菌株pBAD-IscA/iscA-sufA-和pBAD-SufA/iscA-sufA-。 3.iscA和sufA基因的定点突变 以野生型大肠杆菌MC4100的基因组作为模板，经PCR分别扩增出定点突变的DNA片段iscA35，icsA99，iscA101和sufA50，sufA114，sufA116，分别含有IscA-C35S，IscA-C99S，IscA-C101S和SufA-C50S，SufA-C114S，SufA-C116S相应位点上的突变。PCR产物经限制性内切酶NcoⅠ，EcoRⅠ酶切后克隆入表达载体pBAD构建重组质粒pBAD-iscA35，pBAD-iscA99，pBAD-iscA101和pBAD-sufA50，pBAD-sufA114，pBAD-sufA116。将重组质粒分别转化入iscA-sufA-双突变株，构建菌株pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA99/scA-sufA-，pBAD-IscA101/scA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-。L-阿拉伯糖诱导其表达，用Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。 4.构建菌株生长状态测定 分别测定这些构建菌株的生长曲线。 结果： 1.大肠杆菌iscAsufA双突变株的构建利用打靶载体pKOV-iscA-、pKOV-suyA-获得iscA-单突变株，sufA-单突变株及iscA-sufA-双突变株；PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳可见约1kp的目的条带。 2.iscA和sufA基因的导入利用表达载体pBAD将iscA和sufA分别克隆到iscA-sufA-双突变株，得到菌株pBAD-IscA/iscA-sufA-和pBAD-SufA/iscA-sufA-。PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳可见约300bp的目的条带；测序结果证实基因序列正确。 3.iscA和sufA基因的定点突变利用定点突变技术得到定点突变的菌株pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA99/iscA-sufA-，pBAD-IscA101/iscA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-。PCR鉴定经琼脂糖凝胶电泳可见约300bp的目的条带；经L-阿拉伯糖诱导的菌液裂解产物上清通过Tricine-SDS-PAGE电泳在约13kD处可见目的条带；测序结果显示突变位点正确。 4.构建菌株生长状态测定通过以野生型大肠杆菌MC4100作为对照测定生长曲线，结果显示，iscA-和sufA-的生长状态影响不大，而iscA-sufA-双突变株在有氧条件下，在LB培养基中生长缓慢，在基础培养基中几乎不生长；在厌氧条件下，在基础培养基中可以恢复部分生长。pBAD-IscA/iscA-sufA-和pBAD-SufA/iscA-sufA-可以恢复细菌的生长状态，而pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA99/iscA-sufA-，pBAD-IscA101/iscA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-不能恢复细菌的生长状态。 结论： 利用敲除技术成功获得iscA和sufA缺失的双突变株iscA-sufA-，并发现iscA和sufA功能上的互补作用，及进一步证实IscA上三个保守半胱氨酸位点Cys35，Cys99，Cys101和SufA上三个保守半胱氨酸位点Cys50，Cys114，Cys116为其功能的关键位点，为IscA和SufA功能的进一步研究提供实验基础和理论依据。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分iscA，sufA双突变株的构建

材料和方法

结果

第二部分iscA，sufA基因的导入

材料和方法

结果

第三部分iscA，sufA定点突变

材料和方法

结果

第四部分构建菌生长状态测定

材料和方法

结果

讨论

参考文献

致谢

综述 细菌中铁硫蛋白的生物合成机制