肝组织端粒酶、Cyclin D1 mRNA在微囊化肝细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠模型中的动态变化

摘要

目的： 本实验将微囊化肝细胞移植入急性肝衰竭(Acuteliverfailure，ALF)大鼠腹腔内，检测观察大鼠肝功能和肝组织中端粒酶、CyclinDlmRNA的动态变化，初步研究微囊化肝细胞腹腔移植后肝衰竭大鼠肝细胞的增殖情况及肝组织中端粒酶、CyclinDlmRNA的变化和意义。 方法： 1.用Seglen改良二步胰酶灌注法对健康大鼠肝脏进行肝细胞分离及纯化，与2.0％海藻酸钠等材料混匀，在自制装置下制备微囊化肝细胞。 2.随机将雄性成年SD大鼠分成正常对照组和造模组。造模组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)，建立急性肝衰竭大鼠模型，将造模动物随机分成3组：Ⅰ组为ALF模型组；Ⅱ组为裸肝细胞移植组，于造模后18小时腹腔内植入游离同种异体肝细胞；Ⅲ组为微囊化肝细胞移植组，于造模后18小时腹腔内植入微囊化同种异体肝细胞。造模后24h、48h、72h、120h、168h分别从各组中随机取8只大鼠(Ⅰ组尚需观察6h、12h)，留门静脉血观察肝功能变化，取肝组织用半定量RT-PCR方法检测端粒酶、CyclinDlmRNA的动态变化。 结果： 1.每只大鼠分离纯化后所得肝细胞经0.4％台盼蓝染色判断细胞产量可达5×107以上，率达90％以上。在自制装置下制备微囊化肝细胞，经0.4％台盼蓝染色后85％以上肝细胞成活，微囊大小在400μm-800μm之间。 2.模型建立24h后，大鼠表现为极度虚弱、食欲明显减退、嗜睡、抽搐、昏迷等。肝病理学表现为肝细胞坏死广泛而严重，出现弥漫性的大片坏死，细胞溶解，肝索解离，小叶结构模糊不清，肝窦明显扩张并出血，小叶内及汇管区有淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎症细胞浸润，残存肝细胞水肿变性，这表明急性肝功能衰竭动物模型成功建立。 3.各组大鼠肝功能检验发现，造模后6h，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)均已显著升高(P＜0.05)，以48～72h之间为著。48h开始，Ⅱ、Ⅲ组ALT、AST较Ⅰ组明显下降(P＜0.05)。Ⅲ组在48、72h时肝功能下降较Ⅱ组明显(P＜0.05)。另外TBiL在Ⅰ组造模后逐渐升高，72h达最高峰，Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组相比，48h、72h、120h均明显下降(P＜0.05)，其中在48h、72hⅢ组较Ⅱ组下降更明显(P＜0.05)。模型组、裸肝组和微囊组大鼠生存率分别是26.7％(4/15)、40.0％(6/15)、73.3％(11/15)，微囊组较模型组、裸肝组大鼠生存率有显著性提高(P＜0.05)。 4.Ⅱ、Ⅲ组端粒酶、CyclinDlmRNA均在72h、120h和168h较Ⅰ组有明显升高(P＜0.05)，Ⅲ组端粒酶、CyclinDlmRNA在120h和168h均较Ⅱ组有明显升高(P＜0.05)。 结论： 1.腹腔注射D-GalN1.4g/kg一次性造模成功，大鼠状态、死亡率、肝脏组织学及生化学改变符合ALF。 2.Seglen改良二步胰酶灌注法对健康大鼠肝脏进行肝细胞分离及纯化，所得肝细胞产量及活率符合HCT的要求。肝细胞微囊化技术成熟。 3.微囊化肝细胞移植组改善肝功能较裸肝细胞移植组更加显著，说明微囊化肝细胞移植较裸肝细胞移植的治疗效果更加令人满意。 4.微囊化肝细胞移植组肝衰大鼠肝组织中端粒酶、CyclinDl的表达量均显著升高，有利于肝细胞的再生，从而显著改善肝衰大鼠的肝功能和预后。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

第一部分急性肝衰竭大鼠模型建立和微囊化肝细胞的治疗

材料与方法

结果

讨论

第二部分微囊化同种异体肝细胞腹腔移植治疗急性肝衰竭大鼠对肝组织端粒酶、Cyclin D1 mRNA表达的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述：端粒酶的研究进展