中华雪胆有效成分及抗炎活性研究;浙江栽培浙贝母种质遗传多样性的AFLP分析

摘要

第一部分中华雪胆有效成分及抗炎活性研究 目的： 中华雪胆的块根是常用中草药，临床主要用于治疗炎症性疾病。为了探讨药效物质基础，本文对其化学成分进行了较系统的研究。并对3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6'-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)进行了抗炎活性观察。 方法： 将中华雪胆块根粉碎，70％甲醇浸提。合并提取液，减压回收甲醇。浸膏热溶于1500 mL蒸馏水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。用硅胶柱色谱(CC)、中压制备色谱(MPLC)、高压制备色谱(HPLC)等分离技术，从正丁醇、乙酸乙酯浸膏中共获得20个化合物。用UV、IR、MS、NMR等波谱技术及相关文献数据比较，确定了正丁醇浸膏中13个化合物的结构。体外在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7和J774A.1小鼠巨噬细胞上分别用蛋白质印迹、酶联免疫法观察化合物4和11对环氧合酶-1/-2(COX-1、COX-2)蛋白及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IF-6)表达的影响。 结果： 从中华雪胆的乙酸乙酯和正丁醇部位分离得到20个三萜皂苷类化合物，鉴定出其中13个化合物分别为齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-阿拉伯糖苷(2)，3-O-(6'-丁酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)，3-O-(6'-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃甘露糖苷(6)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸(7)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(8)，3-O-(6’-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-阿拉伯糖苷(9)，3-O-(6’-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃甘露糖苷(10)，3-O-(6’-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)，3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)，3-O-β-D-吡喃葡萄糖-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)。 3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6’-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)对COX-1表达无明显影响，但是在RAW264.7和J774A.1小鼠巨噬细胞上两化合物均能使COX-2蛋白的表达降低；也使LPS刺激的J774A.1小鼠巨噬细胞TNF-α、IF-6表达降低。 结论: 除去化合物4和化合物12，其余化合物是首次从中华雪胆中分离得到，它们均属于齐墩果烷型三萜皂苷。3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物4)和3-O-(6'-乙酯)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物11)具有一定的抗炎活性。 第二部分浙江栽培浙贝母种质遗传多样性的AFLP分析 目的: 为了保护浙江省道地种植区栽培浙贝母的优质资源，建立特异、分辨率高的DNA分子标记生物学鉴定方法，为选育优良品种及寻找良种繁育基地提供科学依据，我们采用AFLP分子标记法对省内6个居群的浙贝母栽培品种的遗传多样性进行了分析。 方法: 根据均匀分布、随机取样原则，收集浙贝母主产区鄞州、象山、东阳、磐安、永康、缙云六个种植区人工栽培样本，每个种植乡镇收集4～6个样品，共32份。采用AFLP方法：1、DNA酶切及人工接头的连接(Restriction of the DNAand ligation of oligonucieotidc adapters)，2、限制性片段的选择性扩增(Selective amplification ofsets of restriction fragments)，3、扩增产物凝胶电泳分析(Gel analysis of the amplifiedfragments)。用POPGENE1.32软件计算居群总遗传多样性(Ht)、居群内遗传多样性(Hs)、遗传分化系数(Gst)、基因流(Hm)、Nei遗传多样性指标(h)、Shannon信息指数(I)、遗传距离、并形成聚类图。 结果: 在浙贝母的物种水平上，Nei’s基因多样性指数(He)为0.169 O±0.1757，Shannon’s信息指数(I)为0.2698±0.2453，多态位点百分率(PPB)76.85％；总遗传多样性(Ht)01690±0.0309，其居群水平上遗传多样性(He)0.1508±0.0240，Shannon's信息指数(I)0.2333±0.2619，多态位点百分率(PPB)50.38％，Nei's遗传分化指数(Gst)为0.1076，基因流(Aim)为4.1470。东阳和永康种群之间的遗传距离最小(为0.0150)，距离东阳和永康较近的缙云居群的遗传距离次之(为0.0215)，而象山与缙云最远(为0.0324)。居群间的遗传一致度和遗传距离范围分别是0.9681～0.9851和0.015 O～0.0324。聚类图结果表明：地理位置相对较近的东阳、永康种群表现出较近的亲缘关系首先聚为一类；再与缙云聚为1个亚类；鄞州、磐安种群分别聚为2个亚类；象山种群遗传距离较远，单独聚为一大类。 结论: 浙江省主产区栽培浙贝母物种的遗传多样性水平丰富，高的遗传多样性能够维持浙贝母的长期生存。浙贝母居群间的多样性水平明显低于居群内的多样性水平，居群间遗传分化不明显，而且广泛的基因交流保证了药材品质的均一性和质量的稳定性，也使这些种植区成为选育优良品种的良好基地。但是鄞州和象山两个居群的多样性水平都比平均水平低，而且鄞州是目前浙贝母种植和产量较大的地区，象山是浙贝母最初的种植区，为了保护浙贝母优质资源的可持续性，必须开始重视优良品种的繁育和优良种质基地的建立。

目录

声明

第一部分中华雪胆有效成分及抗炎活性研究

前言

第一章中华雪胆的化学成分研究

第一节材料与方法

第二节化合物结构鉴定

第三节波谱数据

参考文献

第二章化合物4和11对LPS刺激的小鼠巨噬细胞COX-1、COX-2、TNF-α、IF-6表达影响研究

第一节材料与方法

第二节实验结果

第三节讨论与分析

参考文献

第二部分浙江栽培浙贝母种质遗传多样性的AFLP分析

缩词简表

前言

第一节材料与方法

第二节实验结果

第三节讨论与分析

参考文献

附录 科研与论文发表

致谢

综述(一) 雪胆属植物的研究概述

综述(二) 浙贝母研究概述

附图