抗erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)融合蛋白的特性预测及其在Jurkat细胞中的稳定表达

摘要

目的： 1.对融合蛋白anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的性质进行预测和评估，探讨融合基因不同的连接构建方式特点，进一步完善融合基因的构建策略。 2.针对融合基因的构建方法进行优化，建立快速高效的基因连接方法。 3.将已构建的真核表达质粒pLNCX/anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)稳定转染T淋巴瘤细胞(Jurkat细胞)，建立稳定表达融合蛋白的Jurkat细胞株。 即为融合基因的构建策略提供理论指导，验证已构建质粒在真核细胞中稳定表达的可能性，为erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定实验基础。 方法： 1.融合基因蛋白质结构预测 已知融合基因各片段DNA标准序列，由此可知其氨基酸标准序列，故可将各片段组合形成融合基因编码的氨基酸序列，使用SignalP-NN预测信号肽切除点，使用TMHMM预测融合蛋白的跨膜区域位置，利用SOPMA(Self Optimized Prediction Method from Alignment)和SWISS MODEL预测该融合蛋白膜外区的二、三级结构。通过比较二级结构和三级结构，评估两种构建方式的优缺点。 2.采用三引物PCR连接融合基因片段 针对已经连接好的Signal-scFv基因片段和已扩增的Fc-CD28-CD3(ζ)基因片段，设计三引物PCR的引物。将两基因片段以及前引物、中间引物及后引物置于同一PCR管中，以高保真的PCR酶即Pyrobest DNA聚合酶代替普通的Taq酶进行反应。 3.稳定转染人T淋巴瘤细胞株Jurkat并检测融合基因表达情况 应用Lipofectin2000转染试剂盒及电转染将重组表达质粒pLNCX/anti-erbB2scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)转染至Jurkat细胞株。G418筛选一个月，以获得稳定表达蛋白的细胞。提取细胞的基因组DNA，行anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)特异性PCR鉴定。应用流式细胞术检测融合蛋白表达情况。 结果： 1.预测信号肽切割位置在第20和21个氨基酸之间，与预先设计位置(信号肽为1～20个氨基酸)相同。跨膜区在第524～546个氨基酸位置，正是包含在CD28片段(518～590)内部。融合蛋白各部分抗原性较低，理化性质(亲水性、疏水性等)与其相应的功能一致。 2.三引物PCR得到Signal-scFv基因片段和Fc-CD28-CD3(ζ)基因片段直接连接的融合基因片段，大小为2123bp。 3.比较融合基因scFv和Fc之间添加连接肽和不加连接肽的融合蛋白构象 比较预测得到的融合蛋白细胞膜外段的二级结构和三级结构，结果显示，两种构建方式中，单链抗体部分的空间构象正常，保持不变，没有因连接Fc段而改变。与不加连接肽的构建方式相比，加上5个GS连接肽的构建方式对Fc段的结构形成有影响，使正常Fc的β-折叠构象减少，并形成了新的一个α-螺旋，造成功能构象改变。Linker段没有形成预想的无规则卷曲，而是形成了两个较短的β-折叠。 4.脂质体转染细胞失败，提示脂质体仅能瞬时转染悬浮细胞，而不易获得稳定转染细胞。 5.电转染细胞，G418筛选转染细胞，获得大量稳定转染的细胞。anti-erbB2-scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)特异性PCR示目的基因整合入细胞基因组。 6.流式细胞术检测融合蛋白能在Jurkat细胞表面表达，表达量达56.17％。 结论： 1.使用生物信息学预测表明融合蛋白能在信号肽的引导下，借助CD28的跨膜区固定在细胞膜上。但添加的连接肽会影响融合蛋白Fc段正常的空间结构形成。今后的融合基因构建中scFv直接连接Fc比较有利。 2.三引物PCR能够实现两个基因片段的连接，反应在同一管中一次完成，较SOE-PCR有更少的污染几率，提高了效率。 3.脂质体转染效率较低，很难获得稳定转染的Jurkat细胞。电穿孔方法可以获得稳定表达anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的Jurkat细胞。

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论文说明：缩略词表

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前言

材料与方法

实验材料

实验方法

实验结果

分析与讨论

小结

参考文献

附录

致谢

综述 靶向肿瘤的单链抗体融合蛋白的构建策略进展