绍兴黄酒抑制LDLR小鼠MMP-2表达和动脉粥样硬化斑块形成

摘要

目的： 观察绍兴黄酒是否能减轻动脉粥样硬化斑块的形成并探讨其可能机制。 方法： 36只6周龄LDL受体基因缺陷小鼠(LDL receptor knockout mice)，随机分为三组：绍兴黄酒组、红葡萄酒组和对照组，每组12只。以高脂+高蛋氨酸(标准饲料+10％油脂+1.25％胆固醇+1％L-蛋氨酸)喂养形成高同型半胱氨酸血症并致动脉粥样硬化模型，14周后处死小鼠，检测血脂及同型半胱氨酸水平；观察胸腹主动脉粥样硬化情况；测定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达水平；观察主动脉窦部切片H&E和免疫组化染色。 主动脉标本处理： 取血后经左心室冰PBS灌流，高位心脏连同近段主动脉约1mm处离断血管。清除胸腹主动脉周围脂肪组织后，纵向分离血管至肾动脉。主动脉(每组6只)10％福尔马林固定24小时后行70％酒精漂洗30秒，苏丹Ⅳ染色15分钟，80％酒精分化20分钟，流水冲洗1小时。XTZ-E体视显微镜接上尼康D60数码相机，行胸腹主动脉拍照，Image-pro plus6.0图像分析系统分析动脉粥样硬化面积。 H&E染色及免疫组化分析： 石蜡包埋心脏，从高位心脏处以20μm厚连续切片至出现主动脉瓣的圆形动脉组织后，以4μm厚连续切片至瓣上约200μm处，每隔5张切片留取1张行常规H&E染色及MMP-2免疫组化检测(一抗为1：50，Sigma Aldrich公司，产品号：M4065；检测系统为Dako REALTM EnVisionTM，产品号：K5007)。MMP-2免疫组化方法为：常规脱蜡，梯度酒精水化，消除内源性过氧化物酶，高温高压抗原修复，二步法行免疫组化检测。采用LEICA DC3000拍照及Image-Pro Plus6.0软件进行资料分析。 明胶酶谱法： 用组织匀浆机切碎主动脉弓(每组6只)，提取主动脉弓处蛋白20ug。在含1mg/mL明胶的10％聚丙烯酰胺凝胶片上电泳，待溴酚蓝到达凝胶底部，在室温下用含2.5％ Triton X-100洗涤缓冲液平摇洗涤30 min×2；37℃摇床平摇孵育缓冲液(pH8.8，50 mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，0.02％NaN3)中孵育42小时。然后凝胶染色2h(含0.1％考马斯亮兰R-250溶液，10％冰乙酸，45％甲醇溶液，45％去离子水)，脱色(10％冰乙酸，45％甲醇溶液，去离子水45％)直到蓝色背景下出现白色条带，即为MMP-2，双蒸水冲洗终止脱色。用凝胶成像系统进行拍照，用Quantity One4.4软件定量分析。 结果： 1.实验中小鼠平均每日的饮水量约为4ml，饮酒量约1ml，相当于成人每日少量饮酒(1-2杯)。小鼠食物摄入量、饮水量、体重增加量在3组间无明显差别。 2.绍兴黄酒组小鼠血同型半胱氨酸较对照和红葡萄酒组明显下降，但三组间TC、TG、及HDL-C水平无明显差别。 3.所有实验小鼠的主动脉弓处都有粥样硬化斑块形成，其中对照组小鼠最为明显。与对照组相比，绍兴黄酒与红葡萄酒组的主动脉粥样硬化斑块面积减少了33.4％和35.7％(P<0.01)，绍兴黄酒和红葡萄酒组间无统计学差异。绍兴黄酒，红葡萄酒和对照组主动脉窦部粥样硬化面积分别为193392±27171μ㎡/section，188435±26193μ㎡/section和243476±29176μ㎡/section，绍兴黄酒和红葡萄酒与对照组比较均有显著差异(P<0.001)，绍兴黄酒和红葡萄酒之间比较二者之间无显著差异(P>0.05)。 4.与对照组相比，主动脉窦处绍兴黄酒组与红葡萄酒组的MMP-2的表达分别减少了26.8％和25.7％(P<0.001)，但绍兴黄酒和红葡萄酒组之间无统计学差异。明胶酶谱分析主动脉弓MMP-2+pro MMP-2表达分别减少了32.6％和30.2％(P<0.001)，绍兴黄酒组和红葡萄酒组之间无统计学差异。免疫组化染色显示MMP-2的表达主要位于动脉粥样硬化斑块纤维帽下和溃疡处。 结论： 绍兴黄酒能减低LDL受体基因缺陷小鼠血浆同型半胱氨浓度。绍兴黄酒和红葡萄酒均能抑制MMP-2的表达和减轻动脉粥样硬化斑块的形成，这可能是它们对心血管系统保护作用的机制之一。

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小结

参考文献

在读研三年中的科研工作

致谢

文献综述 基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化中的研究进展