CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的克隆表达及酶动力学研究

摘要

目的： 研究CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)在大肠埃希菌中的克隆，表达，纯化，以及酶动力学。应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)与定点突变相结合的技术对CTX-M-14型ESBLs基因型进行筛选，初步探索该技术在检测超广谱β-内酰胺酶的基因突变中的应用。 方法： 1.CTX-M-14在大肠埃希菌中的克隆与表达通过PCR方法扩增温州地区已知产CTX-M-14型ESBLs菌株后将其连接在pET28a质粒载体上，转化至大肠埃希菌BL21，得到CTX-M-14工程菌。将该工程菌诱导表达，优化其诱导条件。鉴定后用His抗体及其二抗对重组蛋白进行蛋白质免疫印迹(Western blot)检测。 2.CTX-M-14的发酵，纯化及酶动力学研究将CTX-M-14工程菌发酵，得到大量菌体后进行亲和层析蛋白纯化以便得到纯度较高的CTX-M-14重组蛋白，分析其纯度和比活性。通过CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶动力学分析，检测该酶对多种抗生素的降解能力。 3.应用DHPLC与定点突变相结合的技术对CTX-M-14型ESBLs基因型进行检测通过PCR方法扩增温州地区ESBLs菌株，运用DHPLC技术进行检测，将CTX-M-14工程菌进行定点突变使其作为DHPLC方法的阳性对照。 结果： 1.CTX-M-14在大肠埃希菌中的克隆与表达CTX-M-14基因成功克隆到pET28a质粒载体上并在大肠埃希菌BL21中成功表达。通过Western blot检测可知该重组蛋白有His标签。 2.CTX-M-14的发酵，纯化及酶动力学研究工程菌株通过发酵得到了250g菌体。纯化后得到了纯度为90％以上的重组蛋白。酶动力学实验显示CTX-M-14型ESBLs能快速降解头孢噻肟，Km值为105.68。浓度为3.43mg/ml的重组蛋白取1ml以头孢噻肟为底物测得酶活力为53IU，比活为15.5IU/mg。 3.应用DHPLC与定点突变相结合的技术对CTX-M-14型ESBLs基因型进行检测63株临床得到的ESBLs菌株中有30例为CTX-M-14型，该分型在本次临床得到的ESBLs菌株中所占比例高达47.6％。 结论： CTX-M-14型ESBLs的克隆、表达与纯化以及酶动力学的研究为临床用药和抗生素清除提供一定的理论指导。DHPLC技术对CTX-M-14型ESBLs的检测为该技术运用在超广谱β-内酰胺酶基因突变检测上的初步探索，为该技术的进一步完善打下基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 CTX-M-14型ESBLs的克隆与表达

材料与方法

结果

分析与讨论

第二部分 CTX-M-14的发酵，纯化及酶动力学研究

材料与方法

结果

分析与讨论

第三部分 应用DHPLC与定点突变相结合的技术对CTX-M-14型ESBLs基因型进行检测

材料与方法

结果

分析与讨论

全文小结

参考文献

致谢

综述：基因工程菌的发酵

附录