人EGF-IL-18的表达优化、表征鉴定及初步活性研究

摘要

目的:
　　 构建EGF-IL-18融合基因的原核表达载体,运用高密度发酵技术获得高表达的EGF-IL-18蛋白,进一步通过纯化、复性获得有活性的EGF-IL-18蛋白,为下一步动物体内生物学作用研究和临床前新药的开发打下基础。
　　 方法:
　　 1.EGF-IL-18原核表达载体的构建和表达采用PCR方法,以质粒pFUS-EGF-IL-18为模板,扩增EGF-IL-18融合基因并引入C12T、C21T、T24C、A543T、C549T、T552C、A558G同义突变,将其克隆入原核表达质粒pET12a(+),构建表达载体pET12a(+)-EGF-IL-18,限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定表达产物。
　　 2.EGF-IL-18高密度发酵条件优化以及纯化复性针对发酵的pH、诱导温度、诱导时机、补料等因素,在10L发酵罐水平的基础上,采用正交设计的方法优化发酵条件。离心收集发酵菌液,压力破碎仪破碎细胞获得目的蛋白包涵体,采用2M尿素洗涤包涵体,8M尿素溶解包涵体,S-100和DEAE-SFF两步法纯化复性目的蛋白,冰冻干燥保存目的蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鉴定及活性检测将纯化复性的融合蛋白EGF-IL-18标记荧光染料Cy3,通过受体配体免疫荧光法检测EGF-IL-18和肿瘤细胞表面EGFR结合。融合蛋白EGF-IL-18与人白血病细胞(KG-1)共培养24 h,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的分泌水平来初步评价EGF-IL-18融合蛋白的复性效果和生物学活性；融合蛋白EGF-IL-18以系列梯度浓度作用于NK-92细胞,CCK-8试剂盒检测NK-92细胞的增殖水平。
　　 结果:
　　 1.原核表达载体的构建和表达双酶切分析、PCR鉴定以及测序结果表明原核表达载体pET12a(+)-EGF-IL-18同设计相符；工程菌E.coli Rosetta(DE3)/pET12a(+)-EGF-IL-18诱导表达后,在分子量为21kDa处可产生特异的表达条带,并能够被抗人IL-18单克隆抗体所识别,与预期一致；C12T、C21T、T24C、A543T、C549T、T552C、A558G突变有利于EGF-IL-18蛋白表达。
　　 2.EGF-IL-18高密度发酵条件优化以及纯化复性 EGF-IL-18融合蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,确定高密度发酵工艺优化条件:pH为7.0,诱导温度为30℃,诱导时机为OD600=1,补料开始时间为4h。各批次发酵中,最高获得湿菌重69.9g/l,通过S-100分子筛和DEAE阴离子交换柱两步法纯化复性后每升发酵液最终获得561mg纯度大于90％的EGF-IL-18融合蛋白。
　　 3.EGF-IL-18蛋白表征鉴定及活性检测激光共聚焦显示EGF-IL-18和A431细胞表面的EGFR特异性结合:IFN-γ ELISA结果显示,EGF-IL-18融合蛋白具有诱导KG-1细胞产生IFN-γ的能力。EGF-IL-18具有刺激NK-92细胞的增殖能力,并呈剂量依赖关系。
　　 结论:
　　 我们成功构建原核表达载体pET12a(+)-EGF-IL-18,通过高密度发酵培养,蛋白纯化复性获得了活性蛋白,为进一步研究融合蛋白的体内、外生物学作用和临床新药开发奠定基础。