姜黄素和B族维生素对冠心病神经病理性疼痛大鼠神经元凋亡和痛阈的影响及机制

摘要

目的：观察姜黄素和B族维生素对糖尿病大鼠神经病理性疼痛阈值的影响及脊髓背角和背根神经节(DRG)中TUNEL阳性细胞、Caspase-3、Bcl-2、Smac和Apaf-1表达的影响。
　　 方法：采用75mg/kg链唑霉素(STZ)单次腹腔注射建立糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型。雄性SD大鼠243只随机分为正常对照组(N)、糖尿病组(D)、溶剂组(SC)、姜黄素组(Cur，100mg/kg)、维生素B1组(VB1，10mg/kg)、维生素B6组(VB6，33mg/kg)、维生素B12组(VB12，1.5mg/kg)、复合维生素组(VBC，VB1＋VB6＋VB12)和姜黄素复合维生素组(VBCCur，Cur＋VBC)，各组于造模14天后每日单次腹腔注射相应药物或溶剂，持续2周。各组别于造模前2天和造模后14天、给药后3、7、14天测定体重、血糖、机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)。于给药后3、7、14天处死大鼠，各时间点均9只，采用TUNEL法检测脊髓背角和背根神经节(DRG)中神经元凋亡情况，免疫组织化学染色法和免疫印迹法测定脊髓和DRG中Caspase-3、Bc1-2、Smac和Apaf-1的表达。
　　 结果：
　　 1、血糖和体重的改变：N组大鼠体重随周龄逐渐增加，D组大鼠STZ诱导2周后体重增加缓慢，在造模后各个时间点均显著低于N组(P＜0.05)；N组大鼠血糖正常，随周龄无明显变化，大鼠造模后血糖浓度为30.9±6.7mmol/L，各时间点血糖均高于16.7mmol/L。
　　 2、行为学的改变：各组在造模后14天MWT(41±10g)和TWL(7.4±2.2s)与基础值相比明显降低(P＜0.05)；给药后7天，VBCCur组、Cur组、VBC组、VB12组MWT和TWL均高于D组(MWT和TWL分别为39±11g和7.5±1.6s)(P＜0.05)；给药后14天，各给药组的MWT和TWL均高于D组（P＜0.05），VBCCur组MWT及TWL分别为57±7g和10.3±1.7s，高于其他给药组(P＜0.05)；SC组与D组各时间点的MWT和TWL之间比较差异无统计学意义。
　　 3、脊髓背角和DRG中凋亡细胞的表达：与N组相比，D组、SC组脊髓背角和DRG中神经元凋亡增加（P＜0.05），D组凋亡指数脊髓背角9.34±0.59％，DRG8.83±0.43％;给药后7天，VBCCur组神经元凋亡减少(脊髓背角8.14±1.26％，DRG7.42±0.21％)，低于D组(P＜0.05)；给药后14天，给药组神经元凋亡减少，均低于D组(P＜0.05)；各时间点VBCCur组与其他给药组相比差异无统计学意义，D组与SC组之间比较差异无统计学意义。
　　 4、脊髓背角和DRG中Bcl-2表达：(1)免疫组化结果显示：与N组相比，D组、SC组脊髓背角和DRG中Bcl-2表达减少(P＜0.05)，D组Bcl-2阳性细胞率脊髓背角9.9±2.9％，DRG17.4±2.1％:给药后7天，VBCCur组的Bcl-2表达高于D组(P＜0.05)，Bcl-2阳性细胞率脊髓背角14.5±2.5％，DRG19.8±4.6％;给药后14天，给药组的Bcl-2表达增高，与D组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；各时间点VBCCur组与其他给药组比差异无统计学意义，D组与SC组之间比较差异无统计学意义。(2)免疫印迹法显示：给药后14天，给药组脊髓和DRGBcl-2蛋白表达增高，与D组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 5、脊髓背角和DRG中Caspase-3表达：(1)免疫组化结果显示：与N组相比，D组、SC组脊髓背角和DRG中Caspase-3表达增多(P＜0.05)，D组Caspase-3阳性细胞率脊髓背角12.1±0.7％，DRG12.4±3.7％；给药后7天，VBCCur组的Caspase-3表达降低，Caspase-3阳性细胞率脊髓9.7±1.8％，DRG为9.7±2.4％，与D组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；给药后14天，给药组的Caspase-3表达低于D组(P＜0.05)；各时间点VBCCur组与其他给药组比差异无有统计学意义，D组与SC组之间比较差异无统计学意义。(2)免疫印迹法显示：给药后14天，给药组脊髓和DRGCaspase-3蛋白表达减少，与D组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 6、脊髓背角和DRG中Smac表达：(1)免疫组化结果显示：与N组相比，D组、SC组脊髓背角和DRG中Smac表达增多(P＜0.05)，D组Smac阳性细胞率脊髓背角11.40±1.37％，DRG9.80±0.81％;给药后7天，VBCCur组的Smac表达降低，Smac阳性细胞率脊髓背角9.64±1.66％，DRG8.94±1.25％，与D组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；给药后14天，VBCCur组、Cur组、VBC组Smac表达低于D组(P＜0.05)，VB1组、VB6组和VB12组与D组相比差异无统计学意义，VBCCur组与VB1组、VB6组、VB12组比差异有统计学意义(P＜0.05)；D组与SC组之间比较差异无统计学意义。(2)免疫印迹法显示：给药后14天，D组的Smac蛋白表达增高，与N组（P＜0.05）相比差异有统计学意义；VBCCur组、Cur组、VBC组Smac蛋白表达低于D组（P＜0.05），VB1组、VB6组和VB12组与D组相比差异无统计学意义。
　　 7、脊髓背角和DRG中Apaf-1表达：(1)免疫组化结果显示：与N组相比，D组、SC组脊髓背角和DRG中Apaf-1表达增多(P＜0.05)，D组Apaf-1阳性细胞率脊髓背角4.45±0.46％，DRG为5.10±0.81％:给药后7天，VBCCur组的Apaf-1表达降低，Apaf-1阳性细胞率脊髓背角3.83±0.61％，DRG为4.31±1.21％，与D组有统计学差异(P＜0.05)；给药后14天，VBCCur组、Cur组、VBC组的Apaf-1蛋白表达低于D组(P＜0.05)，VB1组、VB6组和VB12组与D组相比差异无统计学意义，VBCCur组与VB1组、VB6组、VB12组比差异有统计学意义（P＜0.05）；D组与SC组之间比较无没有统计学意义。(2)免疫印迹法显示：给药后14天，D组的Apaf-1蛋白表达增高，与N组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。VBCCur组、Cur组、VBC组Apaf-1蛋白表达低于D组(P＜0.05)，VB1组、VB6组和VB12组与D组相比差异无统计学意义。
　　 结论：糖尿病神经病理性疼痛大鼠较正常大鼠其痛阈明显降低，脊髓背角和DRG凋亡细胞、促凋亡蛋白表达增多，而抗凋亡蛋白表达减少。姜黄素和B族维生素治疗可显著提高糖尿病神经病理性疼痛大鼠的机械痛阈与热敏痛阈，其机制可能与减少脊髓和DRG中Caspase-3、Smac和Apaf-1表达，上调Bcl-2表达，抑制神经元凋亡有关。