产KPC-2型碳青霉烯酶弗劳地柠檬酸杆菌的研究

摘要

目的：
　　 碳青霉烯类抗生素是治疗产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和AmpC酶肠杆菌科细菌引起的严重感染的一线药物。近年来，肠杆菌科细菌中发现一类新型的质粒介导AmblerA类β-内酰胺酶-肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KlebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)，是近10年来最常见的碳青霉烯酶之一。该酶能够水解碳青霉烯类抗生素，造成对包括亚胺培南、美罗培南在内的所有β-内酰胺类药物耐药，而且对相当一部分非β-内酰胺类药物耐药。本文拟通过筛选出对亚胺培南耐药或敏感性下降的肠杆菌科细菌并检测相关耐药基因，以期了解近年来本地区产KPC肠杆菌科细菌的分布状况；对KPC型碳青霉烯酶基因在菌株间的转移机制进行分析，研究KPC型碳青霉烯酶基因的播散机制。
　　 方法：
　　 应用VITEK-60型全自动微生物分析仪对亚胺培南耐药或敏感性下降的肠杆菌科细菌初次分离株进行鉴定和药敏试验。PCR扩增及测序检测亚胺培南耐药或敏感性下降的肠杆菌科细菌KPC基因，对KPC阳性菌进行AmpC酶头孢西丁三维试验、ESBLs检测、金属酶初筛试验、等电聚焦及PCR扩增测序(AmpC酶、ESBLs和金属酶)相关基因，分析确定KPC阳性菌产生的所有β-内酰胺酶的类型。接合转化试验和Southernblot试验验证blaKPC是否位于质粒上以及质粒是否可接合转移。采用Etest法检测KPC阳性菌、接合子或转化子菌MIC值。对编码blaKPC的质粒测序并分析其周围序列。
　　 结果：
　　 1．菌株筛选和药敏结果：分离到一株携带KPC型碳青霉烯酶基因弗劳地柠檬酸杆菌，弗劳地柠檬酸杆菌对亚胺培南及头孢菌素类抗生素均呈现高水平耐药，对美罗培南为中介耐药，对氨曲南、氨苄西林和复方磺胺甲噁唑耐药且MICs均＞256μg/ml，但转化子对亚胺培南及头孢菌素类抗生素呈现敏感性下降，氨苄西林在转化子中的MICs仍为＞256μg/ml。
　　 2．β-内酰胺酶检测：弗劳地柠檬酸杆菌金属酶初筛结果为阴性；经头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸双纸片协同法检测，弗劳地柠檬酸杆菌产ESBLs；头孢西丁三维试验阳性(即AmpC酶阳性)；通过等电聚焦电泳发现弗劳地柠檬酸杆菌含有等电点为5.4和6.7的β-内酰胺酶条带，推测pI5.4的为TEM-1型β-内酰胺酶和pI6.7的为KPC-2型碳青霉烯酶，但没有发现其它β-内酰胺酶条带。
　　 3．耐药基因检测：经PCR检测，弗劳地柠檬酸杆菌中KPC型碳青霉烯酶基因阳性，经测序与GenBank序号EF062508的序列一致，为blaKPC-2；ESBLs基因PCR检测及测序发现弗劳地柠檬酸杆菌携带blaTEM-1和blaCTX-M-3；AmpC酶基因PCR检测及测序判断弗劳地柠檬酸杆菌携带染色体AmpC基因；未检测到IPM型和VIM型金属酶基因。
　　 4．接合转化试验：经反复试验，未得到接合子。将从原始菌株抽提的质粒通过电转化转入受体菌中，经亚胺培南筛选获得转化子，经PCR和DNA测序，证实blaKPC-2、blaTEM-1和blaCTX-M-3基因阳性，但未检测到AmpC酶基因。
　　 5．质粒谱分析：质粒电泳显示，临床分离菌含有3个质粒，分别约为50kb、4kb和2.5kb，转化子含1个质粒，约为50kb。
　　 6．KPC-2型碳青霉烯酶基因定位及周围序列分析：Southernblot证实临床分离株和转化子的50kb质粒上显示blaKPC-2特异性DNA探针杂交信号，大肠埃希菌V517质粒上没出现检测信号，染色体碎片上出现弱检测信号。blaKPC-2基因周围序列中含有多个转座相关元件，在blaKPC-2和blaTEM-1的上游有ISKpn8转座酶基因和一个由tnpR+tnpA构成的Tn3样转座子结构，在blaKPC-2和blaTEM-1下游有一个ISKpn6-样转座酶基因。
　　 结论：
　　 首次在温州地区分离到一株产KPC-2型碳青霉烯酶的弗劳地柠檬酸杆菌，在菌株中检出blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-3和AmpC基因，blaTEM-1、blaCTX-M-3和blaKPC-2基因共同位于一个约50kb的不能接合转移的质粒上。对blaKC-2基因周围序列分析发现与现有的报道不尽相同，blaKPC-2位于质粒上的复合转座子中，推测该转座子参与blaKPC-2的转移播散。