唐氏综合征患者诱导多能干细胞的诱导

摘要

目的：诱导出唐氏综合征先天性心脏病患者(21三体型、易位型)及正常核型先天性心脏病患者的iPS细胞，观察各型唐氏综合征iPS细胞与正常核型iPS细胞及hES细胞之间的区别。建立唐氏综合征的细胞模型（可用于药物筛选、机制研究、再生医学等）。
　　 方法：在3位先天性心脏病患者开胸手术过程中，取手术切口部位皮肤(约长5mm，宽2mm)进行原代培养。该3位患者分别为拥有正常核型的室间隔缺损患者(VSD2n)、拥有易位型唐氏综合征的房间隔缺损患者(ASDTranslocation)、拥有21三体型唐氏综合征的法洛四联症患者(TOFTrisomy21)。培养出皮肤成纤维细胞(HDF)后，采用Yamanaka经典iPS诱导方法，利用慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC导入该3位患者的皮肤成纤维细胞，经过20～30d的培养，出现类似ES细胞的克隆。挑取该克隆进行培养，待细胞扩增到一定数量后，利用AP染色、免疫细胞荧光染色、荧光定量PCR、半定量PCR、甲基化检测等技术对诱导出的细胞进行形态学、基因表达、OCT4甲基化修饰状态等方面的鉴定。再利用EB悬浮培养法对细胞进行体外分化，用半定量PCR检测各胚层特有基因GATA4、AFP、RUNX1、NESTIN、NCAM的表达情况；并各取5×106个细胞注射到NOD-SCID小鼠皮下，2个月后得到畸胎瘤，行HE染色，来观察iPS细胞在体内的分化情况。各皮肤成纤维细胞及诱导出的iPS细胞均接受核型分析及短串联重复序列分析，确认各细胞的核型和iPS细胞的来源。
　　 结果：1．各组iPS细胞AP染色均阳性，免疫荧光染色OCT4、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81均阳性，均于ES细胞相似。
　　 2．各组iPS细胞与其来源的皮肤成纤维细胞相比，OCT4基因明显去甲基化，表明OCT4重新活化，表达量增加。
　　 3．荧光定量PCR结果提示各组iPS细胞OCT4、SOX2总表达量接近ES细胞的表达水平。而KLF4及c-MYC的总表达量则远高于ES细胞的表达水平。半定量PCR提示各组iPS细胞与其来源的皮肤成纤维细胞相比，有内源性多能性调节基因OCT4及SOX2的表达，但各转入基因并未完全沉默。
　　 4．各组iPS细胞经EB悬浮培养法行体外分化后可见三个胚层特有基因的表达。各组iPS细胞均能在NOD-SCID小鼠皮下形成畸胎瘤，经HE染色后可观察到三个胚层的结构。
　　 5．短串联重复序列分析证实各组iPS细胞均来源于相应的皮肤成纤维细胞。核型分析证实各组iPS细胞与其来源的皮肤成纤维细胞有相同的核型，同时确认2患者患有唐氏综合征。
　　 结论：易位型、21三体型唐氏综合征及正常核型先天性心脏病患者的皮肤成纤维细胞均可经转录因子OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC的导入后，重编程为iPS细胞，具有向各个胚层分化的能力。各组不同核型的iPS细胞在形态学、基因表达、甲基化修饰、分化能力等方面未见明显差异，均与ES细胞相似。