老年脑出血大鼠嗅鞘细胞脑内移植后神经功能恢复的研究

摘要

目的:
　　 通过Nash差速贴壁法培养出供细胞移植用的较高纯度的嗅黏膜来源嗅鞘细胞；应用胶原酶Ⅳ制作稳定的不同年龄大鼠脑出血模型；将老年和年轻大鼠脑出血模型脑内移植嗅鞘细胞后，观察不同年龄脑出血大鼠神经功能恢复的差异。
　　 方法:
　　 一．参照Nash的差速贴壁法培养出嗅鞘细胞，在倒置相差显微镜下观察不同时期嗅鞘细胞的形态；用P75和hoechst免疫荧光双染的方法来鉴定嗅鞘细胞，hoechst用于染细胞核，发蓝光，P75染胞浆，发绿光；通过视野切换来计算嗅鞘细胞的纯度，先在荧光显微镜下数出阳性的嗅鞘细胞，再在相差显微镜下数出所有细胞，两者的百分比即为嗅鞘细胞的纯度。
　　 二．使用KOPF脑立体定向仪在大鼠尾状核注射胶原酶Ⅳ，制作脑出血大鼠模型，尾状核定位：前后囟水平位，前囟向右旁开3mm，冠状缝前0.2mm，硬脑膜向下6.0mm;从大体解剖及神经功能两个方面来评价模型：大体标本观察血肿形态，对偏瘫大鼠进行肢体的功能评价。
　　 三.如上述方法制作的40只（年轻及年老大鼠各20只）脑出血大鼠模型，年轻及年老大鼠各随机分为两组，进行嗅鞘细胞移植入脑出血大鼠脑内的实验研究。
　　 A组：10只年轻大鼠为单纯脑出血组；
　　 B组：10只年轻大鼠为嗅鞘细胞移植组，在脑出血3D后移植已标记的嗅鞘细胞；
　　 C组：10只老年大鼠单纯脑出血组；
　　 D组：10只老年大鼠为嗅鞘细胞移植组，在脑出血3D后移植已标记的嗅鞘细胞。
　　 四组大鼠，分别在移植前1H，移植后第1、3、7、14、21、28天进行神经功能学评分，经统计学分析，判断嗅鞘细胞在老年脑出血大鼠脑内移植后是否能促进偏瘫肢体功能恢复。
　　 结果:
　　 在细胞培养过程中，可以观察到多种嗅鞘细胞的形态，主要有双极细胞、三极细胞、连接成网状的细胞及少量多级细胞和扁平细胞；P75与hoechst免疫荧光双染有大量阳性细胞，在紫外光激发下染细胞核的hoechst发蓝光，在蓝光激发下染胞浆的p75发绿光，证明该细胞为嗅鞘细胞，在荧光显微镜下通过视野切换计算出嗅鞘细胞的纯度达60％;胶原酶Ⅳ制作不同年龄大鼠脑出血模型较稳定：脑内血肿边界清楚、形态较规则，肢体功能障碍明显；脑出血3天后老年组大鼠比年轻组有更严重的神经功能缺失(p＜0.05)；移植后第7天到第21天，不同年龄嗅鞘细胞移植组大鼠的神经功能改善均显著好于单纯脑出血组(p＜0.05);OECs移植后老年组和年轻组促进神经功能恢复无明显差异（p＞0.05）。
　　 结论:
　　 用差速贴壁的方法能培养出纯度达60％的嗅鞘细胞，可满足细胞移植的要求；用胶原酶Ⅳ可制作出重复性好、稳定性佳的不同年龄大鼠脑出血模型；老年大鼠脑出血后较年轻大鼠有更严重的神经功能缺陷；对于老年脑出血大鼠，行嗅鞘细胞移植同样能促进肢体功能恢复。