mtND2基因多态性及其表达、线粒体呼吸功能与精子活力的相关性研究

摘要

目的：
　　 1．研究弱精子症(asthenospermia,AST)精子线粒体ND2(mtND2)基因可能存在的核苷酸变异，比较ND2基因核苷酸总变异率、总错义突变率在弱精子症组和正常组中的差异，寻找ND2基因中可能与弱精子症相关的突变位点。
　　 2．双向等位基因PCR(Bi-PASA)或变性高效液相色谱(DHPLC)筛查弱精子症和正常人群中m.5442T＞C、m.5466A＞G错义突变分布的差异，并分析突变的异质性。
　　 3．分析错义突变引起氨基酸性质及蛋白质二级结构的改变，探讨对编码蛋白质功能可能造成的影响。
　　 4．比较ND2基因mRNA在正常精子和弱精子症精子中表达的差异，探讨ND2基因mRNA表达与精子活力、密度及总数的相关性。
　　 5．通过测定精子线粒体呼吸耗氧，探讨不同活力精子线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O)和氧化磷酸化效率(OPR)之间的差异。
　　 6．检测精子DNA损伤情况，统计分析精子DNA损伤与精子活力、精子线粒体呼吸功能之间存在的相关性。
　　 方法
　　 1．按照世界卫生组织(WHO)标准，选取精子活动力低下(a级＜25％且a+b级＜50％)标本134例。正常对照标本来自经询问病史后确认夫妻结婚后女方先前已怀过孕或者经试管婴儿(invitrofertilization，IVF)成功怀孕的男性，我们收集了112例正常精液标本（a级＞25％且a+b＞50％）作为对照；按同样的方法和标准收集活力低下的精液标本13例和18例，正常对照12例和16例分别用于ND2mRNA表达实验与精子线粒体呼吸及DNA损伤实验。
　　 2．参照《分子克隆实验指南》（第三版）提取精子全基因组DNA，采用PCR扩增ND2基因，纯化后直接测序并与修正后剑桥参考序列(revisedCambridgeReferenceSequence，rCRS)进行比对。
　　 3．借助生物信息学软件ClustalX及蛋白相关数据库，从氨基酸变异情况、蛋白二级结构分析ND2基因变异前后的变化，统计分析ND2基因变异与弱精子症的相关性。
　　 4．采用Trizol试剂盒提取精子总RNA，RT-PCR方法检测ND2mRNA的表达水平，分析ND2mRNA的表达水平与精子活力、密度及精子总数的相关性。
　　 5．采用蔗糖差速离心法或密度梯度离心法提取精子线粒体，通过铂氧电极-溶氧仪测定线粒体呼吸耗氧率并计算线粒体状态Ⅲ呼吸、状态Ⅳ呼吸、呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O)及氧化磷酸化效率(OPR)。
　　 6．应用精子染色质扩散(spermchromatindispersion，SCD)实验检测精子DNA损伤情况，计算DNA碎片指数(DNAfragmentationindex，DFI)，分析精子DFI与精子线粒体呼吸功能之间存在的相关性。
　　 结果
　　 1.74例弱精子症和60例正常对照精液标本经基因序列分析，结果与剑桥序列比对，共检测到ND2基因34个变异位点，其中10个为错义突变，24个为同义突变；再结合Bi-PASA方法继续筛查60例弱精子症和52例正常对照精液标本，在ND2基因中检测到m.5351A＞G、m.5460G＞A和m.5466A＞G变异率弱精子症组显著高于对照组(P＜0.05)，m.5442T＞C变异率对照组显著高于弱精子症组(P＜0.05);其它位点突变率两组间比较均无显著性差异(P＞0.05），推测大部分是一些多态性位点。
　　 2．弱精子症患者中出现的34个变异位点中的6个位点在www.mitomap.org中未见报道，分别是m.4811A＞G、m.4826C＞T、m.4856T＞C、m.4884A＞G、m.5402A＞G、m.54921＞C变异；134例标本全部出现m.4769A＞G变异，nt4769G可能是中国人的特异性碱基；ND2基因平均突变率和平均错义突变率弱精子症组均高于对照组，但无显著性差异(P＞0.05），总突变率和总错义突变率也无显著性差异(P＞0.05)。
　　 3．在ND2基因中发现的10个错义突变中的4个错义突变(m.4491G＞A、m.4924G＞A、m.5460G＞A、m.5466A＞G)仅存在于弱精子症中；有5个突变(m.4824A＞G、m.4833A＞G、m.5178C＞A、m.5460G＞A和m.5466A＞G)导致了编码氨基酸极性的改变，其中m.4824A＞G、m.4833A＞G、m.5466A＞G使极性亲水性氨基酸（苏氨酸）变为非极性疏水氨基酸（丙氨酸），m.5178C＞A、m.5460G＞A使非极性疏水氨基酸（亮氨酸、丙氨酸）变为极性亲水性氨基酸（甲硫氨酸、苏氨酸）；预测3个具有显著性差异的错义突变导致ND2亚单位二级结构的改变，发现m.5466A＞G(氨基酸位点T333A)突变导致了ND2亚单位二级结构发生改变。
　　 4．经RT-PCR检测发现，ND2mRNA在正常精子和弱精子症精子中均有不同程度的表达，与活力正常的精子比较，弱精子症精子中ND2表达水平显著降低(P＜0.05)；两组精子密度及精子总数与ND2表达水平均无明显的相关性(r密度=0.234,P密度＞0.05，r总数=0.07,P教＞0.05)。
　　 5．不同活力精子线粒体状态Ⅲ呼吸之间都具显著性差异(P＜0.05）；弱精子症精子线粒体RCR和OPR与正常组比较，分别降低了17.03％和59.26％，其组间比较均具有显著性差异（P＜0.05），而P/O在两组间的差异无显著性(P＞0.05）。
　　 6．分析线粒体呼吸状态与精子DNA损伤的相关性，显示精子DNA损伤与精子活力、线粒体状态Ⅲ呼吸和氧化磷酸化效率(OPR)均呈极显著负相关(r值分别是-0.812、-0.788和-0.696，P＜0.01)，而与蛋白浓度和呼吸控制率(RCR)均无显著相关性(P＞0.05）。
　　 结论
　　 1．ND2基因存在大量变异位点，线粒体基因突变尤其是错义突变多数可能对精子活力有影响并有积累效应，例如我们研究中发现的m.5460G＞A和m.5466A＞G突变可能是导致精子活力降低的一些因素；而少数变异可能对精子活力有保护作用，如m.5442T＞C变异可能会降低弱精子症的患病风险。
　　 2．人精子ND2mRNA表达减少可能是影响精子活力的原因之一；而ND2mRNA表达水平与精子的生成可能无相关性。
　　 3．精子线粒体的呼吸耗氧及氧化磷酸化功能与精子活力之间存在着密切的联系，线粒体结构的破坏特别是内膜结构的损伤对精子活力有较大的影响。
　　 4．精子DNA损伤可能影响精子的正常功能，如影响线粒体呼吸功能从而导致精子活力下降。