抗生素对穿通支原体诱导小鼠膀胱移行细胞癌干预作用实验研究

摘要

目的:
　　 本研究旨在探讨抗生素对穿通支原体(MycoplsamaPenetrans，Mpe)诱导免疫缺陷小鼠膀胱移行细胞癌的干预作用，为临床上免疫缺陷患者协同穿通支原体感染诱导膀胱移行细胞癌的预防提供实验依据。
　　 方法:
　　 1．培养基：制备改良SP-4(用于Mpe的分离培养)液体和固体培养基。
　　 2．菌株来源：标准菌株Mpe(GTU-54-6A1)由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠。
　　 3．菌液的制备：将保存于-20℃的冻干菌株接种于2ml改良SP-4培养基中，置于37℃，5％CO2孵箱中复苏，待菌种至最佳生长期，取0.2ml菌液接种于1.8mlSP-4培养基中，以此方法传3代，待支原体生长至对数期收集离心后的沉淀物，并每次进行菌落计数，备用。
　　 4．抗菌药物准备：抗菌药物稀释参照文献[1,2]操作。菌株最小杀菌浓度(MBCs)和最小抑菌浓度(MICs)测定：MBCs(Minimalbactericidalconcentration)测定采用试管法，MICs(Minimalinhibitoryconcentrations)，采用平板法，参照文献[3，4]操作进行。
　　 5．实验动物与分组：120只清洁级小鼠，16-20g/只，雌性，由温州医学院动物实验中心提供，
　　 5.1.免疫抑制状态小鼠的制备：隔日腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg/d)，5次制成免疫抑制模型。
　　 5.2．小鼠干预模型制备：
　　 实验组：免疫抑制小鼠随机分为3组。红霉素干预组、克林霉素干预组和左旋氧氟沙星干预组，上行感染对数生长期的支原体菌液，同时肌肉注射相应抗生素。对照组：小鼠分3组，免疫抑制Mpe感染组、非免疫抑制Mpe感染组和NS组，分别注入同等剂量Mpe菌液或NS。实验各组在第4周，8周，18周分批宰杀，无菌心脏取血后，取小鼠膀胱组织进行微生物学、病理组织学及形态学检查及免疫组化检查。
　　 6．实验动物血液Mpe再培养，并进行菌落计数，观察抗生素干预后小鼠血清中Mpe菌落数量的改变。
　　 7．光镜观察各组小鼠膀胱组织的病理学变化。
　　 8．电镜标本的制作与观察：分别取各组小鼠的膀胱组织经2.5％戊二醛和1％锇酸双重固定，丙酮梯度脱水，Epon-812环氧树脂包埋，RMC-PT超薄切片机切片，半薄切片光镜定位于组织实质细胞部分，超薄切片经铅-铀双重染色，H-7500透射电镜下观察，拍片。
　　 9．细胞凋亡蛋白检测：免疫组化法检测小鼠膀胱组织中Bax，Bc1-2蛋白表达，观察抗生素干预后小鼠膀胱移行上皮细胞凋亡蛋白表达量的改变。
　　 10.统计学分析：采用SPSS13.0软件对所得数据进行单因素方差分析、X2检验和Fisher确切概率法进行数据处理。
　　 结果:
　　 1．Mpe再培养
　　 实验组和Mpe感染对照组小鼠的血培养均为支原体培养阳性，NS对照组血培养均为支原体培养阴性。实验组和Mpe感染对照组血液培养均转接种到固体培养基上，显微镜下观察到支原体特征性“油煎蛋”样菌落，实验组(红霉素组、克林霉素组及左旋氧氟沙星组)与Mpe感染对照组相比，菌落数量明下降(P＜0.01)。
　　 2．光镜观察
　　 实验组和Mpe感染对照组在感染4周、8周后，小鼠膀胱移行上皮细胞未出现明显变化；实验组感染18周后，小鼠膀胱移行上皮细胞排列整齐，细胞核水肿，胞质有空泡，存在炎症现象；Mpe感染对照组在感染18周后，小鼠膀胱移行上皮细胞排列紊乱，大小不一，核增大，且免疫抑制Mpe感染组更为明显；NS对照组的小鼠膀胱移行上皮细胞4周、8周、18周均未见明显变化。
　　 3．电镜观察
　　 实验组小鼠18周后膀胱上皮细胞核型规则，未见分裂相，仅见细胞水肿，胞质空泡，有炎症现象；Mpe感染对照组感染18周后，小鼠膀胱移行上皮细胞均可见细胞膜溶解缺损，胞核不规则，核仁明显，部分早期凋亡，胞浆内有空泡形成，内质网扩张明显，核分裂像明显，有肿瘤细胞浸润，且在肿瘤细胞内发现支原体，同时免疫抑制Mpe感染组小鼠膀胱移行上皮细胞恶性转化程度高于非免疫抑制Mpe感染组；NS对照组感染4周、8周、18周后，小鼠膀胱移行上皮细胞未见恶性转化。
　　 4．细胞凋亡蛋白Bc1-2和Bax蛋白表达变化：
　　 利用免疫组化法检测小鼠膀胱组织中Bc1-2和Bax蛋白表达，结果显示：各实验组(红霉素组、克林霉素组及左旋氧氟沙星组)与免疫抑制Mpe感染组相比，Bc1-2蛋白表达量明下降(P＜0.05)；NS对照组与免疫抑制Mpe感染组相比Bc1-2蛋白表达量明下降(P＜0.05)；NS对照组与实验组之间，以及各个实验组(红霉素组和克林霉素组及左氧氟沙星组)之间Bc1-2蛋白表达虽然有部分差异，但不具有统计学意义；NS对照组与实验组之间，以及各个实验组(红霉素组和克林霉素组及左氧氟沙星组)之间Bc1-2蛋白表达虽然有部分差异，但不具有统计学意义；各组Bax蛋白表达无显著性差异。
　　 以上结果表明，红霉素、克林霉素及左旋氧氟沙星能降低Bc1-2蛋白的表达，此结果与电镜下观察结果相吻合，此结果提示红霉素、克林霉素及左旋氧氟沙星对穿通支原体诱导小鼠膀胱移行细胞癌具有一定干预作用
　　 结论:
　　 1．Mpe上行感染可诱导小鼠膀胱移行细胞癌的发生，感染后4周和8周未见突变的癌变细胞，直至18周后见突变的癌细胞。并且癌变的恶性程度与宿主的免疫状态有关。
　　 2．Mpe感染对照组小鼠膀胱移行细胞癌与凋亡蛋白Bc1-2/Bax平衡失调相关。
　　 3．红霉素、克林霉素及左旋氧氟沙星对Mpe感染引起免疫抑制小鼠膀胱移行细胞癌的产生具有干预作用。